Produksjon og visualisering av bakteriell Spheroplasts og Protoplasts for å karakterisere antimikrobielle peptid lokalisering
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å produsere gram-negative Escherichia coli (E. coli) spheroplasts og gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) protoplasts tydelig visualisere og raskt karakterisere peptid-bakterier interaksjoner. Dette gir en systematisk metode for å definere membran lokalisere og translocating peptider.
Abstract
Bruk av AC confocal mikroskopi som metode for å vurdere peptid lokalisering mønstre i bakterier er vanligvis hemmet av oppløsningen grensene for konvensjonelle lys mikroskop. Som oppløsning for en gitt mikroskopet ikke kan være lett forbedret, presenterer vi for å transformere liten stav-formet gram-negative Escherichia coli (E. coli) og gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) kalt spheroplasts eller protoplasts til større, lett fotografert sfæriske former. Denne transformasjonen kan observatører å raskt og tydelig avgjøre om peptider lodge seg i den bakterielle membranen (dvs. membran lokalisere) eller krysse membranen for å angi cellen (dvs. translocating). Med denne tilnærmingen presenterer vi også en systematisk metode for å karakterisere peptider som membran lokalisere eller translocating. Stund denne metoden kan brukes for en rekke membran-aktiv peptider og bakteriell stammer, viser vi nytten av denne protokollen ved å observere samspillet av Buforin II P11A (BF2 P11A), en antimikrobiell peptid (AMP), med E. coli spheroplasts og B. megaterium protoplasts.
Introduction
Antimikrobielle peptider (ampere) har fått oppmerksomhet potensielle bruken som alternativer til vanlig antibiotika,1,,2,,3,,4,,5. Forsterkere drepe bakterier ved enten translocating over cellemembranen og samarbeidsstil intracellular komponenter som nukleinsyrer eller permeabilizing membranen forårsaker lekkasje av cellen innholdet6. I tillegg til deres bruk som antibiotika, kan translocating forsterkere tilpasses for stoffet levering programmer fordi de kan ikke disruptively krysser den ugjennomtrengelige cellemembranen7,8. Vi derfor forsøke å forstå grunnleggende AMP virkningsmekanismer å legge grunnlaget for deres bruk i stoff design.
AC confocal mikroskopi tilbyr en måte å vurdere lokalisering mønstre av fluorescently merket ampere i bakterielle celler å gi innsikt i deres mekanisme handling9,10,11,12, 13 , 14. ved merking membran av bakterier, kan man avgjøre hvis en fluorescently merket peptid regionaliserer membran eller intracellulær løpet av en bakteriell celle. Men er denne teknikken begrenset av liten størrelse og rod form av bakterier, som kan gjøre imaging utfordrende oppløsningen grensene for konvensjonelle lys mikroskop og variabel retningen av bakterier på lysbildet15.
Målet med presentert metoden er å aktivere forbedret visualisering fluorescently merket peptid lokalisering mønstre med AC confocal mikroskopi. Visualisering er forbedret ved å slå av liten, tynn, stav-formet gram-negative Escherichia coli (E. coli) og gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) bakterier i forstørret, sfæriske former omtales som spheroplasts (for gram-negative stammer) og protoplasts (for gram-positive stammer)16,17,18,19,20,21. Spheroplasts og protoplasts er enklere å bildet på grunn av både økt størrelsen og fasongen symmetrisk, som gjør retningen for en bakterie på et lysbilde irrelevante for sin imaging. I tillegg presenterer vi en systematisk tilnærming for å analysere kvantitativt AC confocal mikroskopi data for å karakterisere forsterkere som enten membran lokalisere eller translocating. Bruk disse metodene, gjør det enklere å skille fluorescently merket peptid lokalisering mønstre. Protokollene presenteres her kan brukes til å vurdere lokaliseringen av en rekke membran-aktive agenter enn forsterkere, inkludert celle-gjennomtrengende peptider.
En klar fordel av denne teknikken er at det gir innsikt i virkningsmekanismen av forsterkere på en enkelt celle-nivå, som kan avsløre celle til celle heterogenitet15, i motsetning til andre fluorescens analyser vanligvis brukes til å identifisere den virkningsmekanismer av forsterkere, som bare gir bulk estimater9,22,23,24,25. Bruk av spheroplasts og protoplasts for å vurdere AMP celleoppføring er spesielt nyttig26 fordi de er mer fysiologisk relevante15 enn andre modeller brukt for å vurdere celleoppføring, som lipid blemmer24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollene presenteres her gjør det mulig for forskere raskere få større utvalgene av bakteriell bilder fordi forstørret, sfærisk bakterier er mye lettere å finne orientere og bilde. Dette styrket evne til å samle inn data er verdifulle på flere måter. Først, muliggjør en mer systematisk kvantitativ analyse av peptid lokalisering mønstre. Mens kvalitativ trender kan påvises fra mindre settene med bilder, bare et stort utvalg sett av bilder med høy kvalitet avslører mer nyansert trender i lokalisering mø…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning ble støttet av National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer (NIH-NIAID) award R15AI079685.
Materials
| Trizma hydrocloride (Tris HCl) | Sigma | T3253 | |
| Trizma base (Tris OH) | Sigma | T1503 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | 106361 | Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement |
| Cephalexin hydrate | Sigma | C4895 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| BBL Trypticase soy broth | Fisher Scientific | B11768 | |
| BF2 P11A FITC | NeoScientific | Custom ordered | |
| di-8-ANEPPS | Biotium | 61012 | |
| DMSO | Sigma | 34869 | Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane | Pall Corporation | 4192 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 II | For image acquisition |
| Leica Application Suite, Advanced Fluorescence | Leica Microsystems | For image processing |
References
- Baltzer, S. A., Brown, M. H. Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics. Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20 (4), 228-235 (2011).
- Hancock, R. E., Sahl, H. G. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nature Biotechnology. 24 (12), 1551-1557 (2006).
- Jenssen, H., Hamill, P., Hancock, R. E. Peptide antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews. 19 (3), 491-511 (2006).
- Toke, O. Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections. Biopolymers. 80 (6), 717-735 (2005).
- Wang, G., et al. Antimicrobial peptides in 2014. Pharmaceuticals. 8 (1), 123-150 (2015).
- Epand, R. M., Vogel, H. J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim Biophys Acta. 1462, 11-28 (1999).
- Drin, G., Rousselle, C., Scherrmann, J. -. M., Rees, A. R., Temsamani, J. Peptide Delivery to the Brain via Adsorptive-Mediated Endocytosis: Advances With SynB Vectors. AAPS PharmSciTech. 4 (4), 61-67 (2002).
- Splith, K., Neundorf, I. Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa. European Biophysics Journal. 40 (4), 387-397 (2011).
- Bustillo, M. E., et al. Modular analysis of hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide consisting of membrane translocating and membrane permeabilizing fragments. Biochim Biophys Acta. 1838 (9), 2228-2233 (2014).
- Koo, Y. S., et al. Structure-activity relations of parasin I, a histone H2A-derived antimicrobial peptide. Peptides. 29 (7), 1102-1108 (2008).
- Libardo, M. D., Cervantes, J. L., Salazar, J. C., Angeles-Boza, A. M. Improved bioactivity of antimicrobial peptides by addition of amino-terminal copper and nickel (ATCUN) binding motifs. ChemMedChem. 9 (8), 1892-1901 (2014).
- Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of Action of the Antimicrobial Peptide Buforin II: Buforin II Kills Microorganisms by Penetrating the Cell Membrane and Inhibiting Cellular Functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 253-257 (1998).
- Park, C. B., Yi, K. -. S., Matsuzaki, K., Kim, M. S., Kim, S. C. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8245-8250 (2000).
- Pavia, K. E., Spinella, S. A., Elmore, D. E. Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1818 (3), 869-876 (2012).
- Wei, L., LaBouyer, M. A., Darling, L. E., Elmore, D. E. Bacterial Spheroplasts as a Model for Visualizing Membrane Translocation of Antimicrobial Peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (10), 6350-6352 (2016).
- Chassy, B. M., Giuffrida, A. Method for the Lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme. Appl. Environ. Microbiol. 39 (1), 153-158 (1980).
- Fitz-James, P. C. Cytological and Chemical Studies of the Browth of Protoplasts of Bacillus megaterium. J. Biophysic. and Biochem. Cytol. 4 (3), 257-266 (1958).
- Martinac, B., Buechner, M., Delcour, A. H., Adler, J., Kung, C. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 2297-2301 (1986).
- Martinac, B., Rohde, P. R., Cranfield, C. G., Nomura, T. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Methods Mol Biol. 966, 367-380 (2013).
- Nadeau, J. L. . Introduction to Experimental Biophysics: Biological Methods for Physical Scientists. , (2016).
- Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Physical properties of Escherichia coli spheroplast membranes. Biophysical Journal. 107 (9), 2082-2090 (2014).
- Branco, P., Viana, T., Albergaria, H., Arneborg, N. Antimicrobial peptides (AMPs) produced by Saccharomyces cerevisiae induce alterations in the intracellular pH, membrane permeability and culturability of Hanseniaspora guilliermondii cells. Int J Food Microbiol. 205, 112-118 (2015).
- Kobayashi, S., et al. Membrane Translocation Mechanism of the Antimicrobial Peptide Buforin 2. Biochimie. 43 (49), 15610-15616 (2004).
- Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. J Vis Exp. (59), e3571 (2012).
- van der Kraan, M. I., et al. Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin. Peptides. 25 (2), 177-183 (2004).
- Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Biophys J. 111 (1), 132-139 (2016).
- Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II. Peptides. 32 (4), 677-682 (2011).
- Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor. Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).
- Decad, G. M., Nikaido, H. Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall. J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), E303-E310 (2015).
- Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes. Biophys J. 114 (2), 368-379 (2018).
- Ruthe, H. J., Adler, J. Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields. Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).
