Produktion och visualisering av bakteriell Spheroplasts och Protoplasts för att karakterisera antimikrobiell peptid lokalisering
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att producera gramnegativa Escherichia coli (E. coli) spheroplasts och grampositiva Bacillus megaterium (B. megaterium) protoplasts att tydligt visualisera och snabbt karakterisera peptid-bakterier interaktioner. Detta ger en systematisk metod för att definiera membran lokalisering och translocating peptider.
Abstract
Användningen av konfokalmikroskopi som en metod för att bedöma peptid lokalisering mönster inom bakterier är ofta hämmas av resolution gränserna för konventionella ljus Mikroskop. Upplösningen för en given mikroskopet kan inte vara lätt förbättrade, presenterar vi protokoll för att omvandla små stavformad gramnegativ Escherichia coli (E. coli) och grampositiva Bacillus megaterium (B. megaterium) till större, enkelt avbildad sfäriska former kallas spheroplasts eller protoplasts. Denna omvandling tillåter observatörer att snabbt och tydligt avgöra om peptider inge sig i bakteriell membranet (dvs membran lokalisera) eller korsa membranet för att ange cellen (dvs. translocating). Med detta synsätt presenterar vi också en systematisk metod för att karaktärisera peptider som membran lokalisera eller translocating. Medan denna metod kan användas för en mängd olika membran-aktiva peptider och bakteriestammar, vi visar nyttan av detta protokoll genom att observera samspelet mellan Buforin II P11A (BF2 P11A), en antimikrobiell peptid (AMP), med E. coli spheroplasts och B. megaterium protoplasts.
Introduction
Antimikrobiella peptider (ampere) har fått uppmärksamhet på grund av deras potentiella användning som alternativ till konventionell antibiotika1,2,3,4,5. Ampere döda bakterier genom antingen translocating över cellmembranet och interagera med intracellulära komponenter såsom nukleinsyror eller av permeabilizing membranet orsakar läckage av cell innehållet6. Förutom deras användning som antibiotika, kan translocating ampere anpassas för drug delivery program eftersom de kan icke-disruptively korsar den ogenomträngliga cellmembran7,8. Vi söker därför att förstå grundläggande AMP verkningsmekanismer att lägga grunden för deras användning i läkemedelsdesign.
Konfokalmikroskopi erbjuder ett sätt att bedöma lokalisering mönster fluorescently märkt ampere i bakterieceller som ger insikter i deras mekanism för åtgärd9,10,11,12, 13 , 14. genom märkning membranet i bakterier, kan man bestämma om en fluorescently märkt peptid lokaliserar till membranet eller det intracellulära utrymmet i en bakteriecell. Denna teknik är dock begränsad av liten storlek och rod formen av bakterier, vilket kan göra imaging utmanande på grund av upplösning gränserna för konventionella ljus Mikroskop och varierande orienteringen av bakterier på bild15.
Målet med denna metod är att möjliggöra bättre visualisering av de fluorescently märkt peptid lokalisering mönster med konfokalmikroskopi. Visualisering förstärks genom att vrida de små, tunna, stavformad gramnegativ Escherichia coli (E. coli) och grampositiva Bacillus megaterium (B. megaterium) bakterier till utvidgade, sfäriska former kallas spheroplasts (för gramnegativa stammar) och protoplasts (för grampositiva stammar)16,17,18,19,20,21. Spheroplasts och protoplasts är lättare att bilden på grund av både sin ökad storlek och sin symmetriska form, vilket gör orienteringen av en bakterie på ett objektsglas irrelevant för dess avbildning. Dessutom presenterar vi en systematisk metod att kvantitativt analysera konfokalmikroskopi data för att karaktärisera ampere som antingen membran lokalisera eller translocating. Tillämpa dessa metoder gör det lättare att skilja fluorescently märkt peptid lokalisering mönster. De protokoll som presenteras här kan användas för att bedöma lokaliseringen av en mängd olika membran-aktiva agenter än ampere, inklusive cell-penetrerande peptider.
En klar fördel av denna teknik är att det ger insikter om verkningsmekanismen ampere på en enda cell-nivå, vilket kan avslöja cell till cell heterogenitet15, i motsats till andra fluorescens-analyser som vanligen används för att identifiera den verkningsmekanismer för ampere, som endast ger bulk uppskattningar9,22,23,24,25. Användning av spheroplasts och protoplasts för att bedöma AMP cellinmatning är särskilt användbar26 eftersom de är mer fysiologiskt relevanta15 än andra modeller som används för att bedöma cellinmatning, såsom lipid blåsor24.
Protocol
Representative Results
Discussion
De protokoll som presenteras här gör det möjligt för forskare att snabbare erhålla större stickprovsstorlekar bakteriell bilder eftersom de utvidgade, sfäriska bakterierna är mycket lättare att hitta, orientera och bild. Denna förbättrade förmåga att samla in data är värdefullt i flera avseenden. Först, det gör en mer systematisk kvantitativ analys av peptid lokalisering mönster. Medan kvalitativa trender kan påvisas från mindre uppsättningar av bilder, endast en stort urval uppsättning högkvalitat…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning stöds av nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar (NIH-NIAID) award R15AI079685.
Materials
| Trizma hydrocloride (Tris HCl) | Sigma | T3253 | |
| Trizma base (Tris OH) | Sigma | T1503 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | 106361 | Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement |
| Cephalexin hydrate | Sigma | C4895 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| BBL Trypticase soy broth | Fisher Scientific | B11768 | |
| BF2 P11A FITC | NeoScientific | Custom ordered | |
| di-8-ANEPPS | Biotium | 61012 | |
| DMSO | Sigma | 34869 | Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane | Pall Corporation | 4192 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 II | For image acquisition |
| Leica Application Suite, Advanced Fluorescence | Leica Microsystems | For image processing |
References
- Baltzer, S. A., Brown, M. H. Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics. Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20 (4), 228-235 (2011).
- Hancock, R. E., Sahl, H. G. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nature Biotechnology. 24 (12), 1551-1557 (2006).
- Jenssen, H., Hamill, P., Hancock, R. E. Peptide antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews. 19 (3), 491-511 (2006).
- Toke, O. Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections. Biopolymers. 80 (6), 717-735 (2005).
- Wang, G., et al. Antimicrobial peptides in 2014. Pharmaceuticals. 8 (1), 123-150 (2015).
- Epand, R. M., Vogel, H. J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim Biophys Acta. 1462, 11-28 (1999).
- Drin, G., Rousselle, C., Scherrmann, J. -. M., Rees, A. R., Temsamani, J. Peptide Delivery to the Brain via Adsorptive-Mediated Endocytosis: Advances With SynB Vectors. AAPS PharmSciTech. 4 (4), 61-67 (2002).
- Splith, K., Neundorf, I. Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa. European Biophysics Journal. 40 (4), 387-397 (2011).
- Bustillo, M. E., et al. Modular analysis of hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide consisting of membrane translocating and membrane permeabilizing fragments. Biochim Biophys Acta. 1838 (9), 2228-2233 (2014).
- Koo, Y. S., et al. Structure-activity relations of parasin I, a histone H2A-derived antimicrobial peptide. Peptides. 29 (7), 1102-1108 (2008).
- Libardo, M. D., Cervantes, J. L., Salazar, J. C., Angeles-Boza, A. M. Improved bioactivity of antimicrobial peptides by addition of amino-terminal copper and nickel (ATCUN) binding motifs. ChemMedChem. 9 (8), 1892-1901 (2014).
- Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of Action of the Antimicrobial Peptide Buforin II: Buforin II Kills Microorganisms by Penetrating the Cell Membrane and Inhibiting Cellular Functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 253-257 (1998).
- Park, C. B., Yi, K. -. S., Matsuzaki, K., Kim, M. S., Kim, S. C. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8245-8250 (2000).
- Pavia, K. E., Spinella, S. A., Elmore, D. E. Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1818 (3), 869-876 (2012).
- Wei, L., LaBouyer, M. A., Darling, L. E., Elmore, D. E. Bacterial Spheroplasts as a Model for Visualizing Membrane Translocation of Antimicrobial Peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (10), 6350-6352 (2016).
- Chassy, B. M., Giuffrida, A. Method for the Lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme. Appl. Environ. Microbiol. 39 (1), 153-158 (1980).
- Fitz-James, P. C. Cytological and Chemical Studies of the Browth of Protoplasts of Bacillus megaterium. J. Biophysic. and Biochem. Cytol. 4 (3), 257-266 (1958).
- Martinac, B., Buechner, M., Delcour, A. H., Adler, J., Kung, C. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 2297-2301 (1986).
- Martinac, B., Rohde, P. R., Cranfield, C. G., Nomura, T. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Methods Mol Biol. 966, 367-380 (2013).
- Nadeau, J. L. . Introduction to Experimental Biophysics: Biological Methods for Physical Scientists. , (2016).
- Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Physical properties of Escherichia coli spheroplast membranes. Biophysical Journal. 107 (9), 2082-2090 (2014).
- Branco, P., Viana, T., Albergaria, H., Arneborg, N. Antimicrobial peptides (AMPs) produced by Saccharomyces cerevisiae induce alterations in the intracellular pH, membrane permeability and culturability of Hanseniaspora guilliermondii cells. Int J Food Microbiol. 205, 112-118 (2015).
- Kobayashi, S., et al. Membrane Translocation Mechanism of the Antimicrobial Peptide Buforin 2. Biochimie. 43 (49), 15610-15616 (2004).
- Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. J Vis Exp. (59), e3571 (2012).
- van der Kraan, M. I., et al. Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin. Peptides. 25 (2), 177-183 (2004).
- Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Biophys J. 111 (1), 132-139 (2016).
- Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II. Peptides. 32 (4), 677-682 (2011).
- Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor. Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).
- Decad, G. M., Nikaido, H. Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall. J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), E303-E310 (2015).
- Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes. Biophys J. 114 (2), 368-379 (2018).
- Ruthe, H. J., Adler, J. Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields. Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).
