Üretim ve bakteriyel Spheroplasts ve önceki antimikrobiyal peptid yerelleştirme karakterize etmek için görselleştirme
Summary
Burada Ayagin Gram-negatif Escherichia coli (e.coli) üretmek için bir protokol mevcut spheroplasts ve gram-pozitif Bacillus megaterium (B. megaterium) önceki açıkça görselleştirmek ve hızla karakterize peptid-bakteri etkileşimler. Bu yerelleştirme ve peptidler translocating membran tanımlamak için sistematik bir yöntem sağlar.
Abstract
Peptid yerelleştirme desenleri bakteri içinde değerlendirmek için bir yöntem olarak confocal mikroskobu kullanımı yaygın olarak konvansiyonel ışık mikroskoplar çözünürlük sınırları ile engellenir. Kolayca çözümlemesi için verilen mikroskop geliştirilemez gibi biz küçük çubuk şekilli gram-negatif Escherichia coli (e.coli) ve gram-pozitif Bacillus megaterium (B. megaterium) dönüştürmek için protokolleri mevcut daha büyük, kolayca görüntülü küresel formlara spheroplasts veya önceki adı. Bu dönüşüm gözlemciler hızla ve açıkça peptidler kendilerini (Yani, membran yerelleştirme) bakteriyel membran lodge veya girin (Örneğin, translocating) hücre membran çapraz belirlemek izin verir. Bu yaklaşım ile biz de peptidler yerelleştirme veya translocating membran karakterize etmek için sistematik bir yöntem mevcut. Bu yöntem çeşitli membran-aktif peptidler ve bakteri suşları için kullanılabilir iken, biz göstermek belgili tanımlık yarar bu protokolün Buforin II P11A arasındaki etkileşimin gözlemleyerek (BF2 P11A), E. coli ile antimikrobiyal bir peptid (AMP), spheroplasts ve d. megaterium önceki.
Introduction
Antimikrobiyal peptidler (amper) önem onların potansiyel kullanım nedeniyle konvansiyonel antibiyotik1,2,3,4,5alternatif olarak kazanmıştır. Amper ya hücre zarı arasında translocating ve hücre içi bileşenleri veya nükleik asitler gibi ile etkileşerek hücre içeriği6kaçağı neden membran permeabilizing tarafından bakterileri öldürmek. Sigara zorlanarak geçirimsiz hücre zarı7,8çapraz olabilir çünkü antibiyotik olarak kullanımlarının yanı sıra, amper translocating ilaç teslim uygulamalar için adapte. Biz, bu nedenle, temel AMP mekanizmaları uyuşturucu tasarımda kullanımları için zemin hazırlamaya eylem anlamak arıyorlar.
Confocal mikroskobu yerelleştirme desenleri fluorescently etiketli amper onların mekanizması eylem9,10,11,12, ilgili bilgiler sağlayan bakteri hücreleri içinde değerlendirmek için bir yol sunar 13 , 14. bakteri membran etiketleme tarafından kimse fluorescently etiketli bir peptid membran veya bakteri hücre hücre içi boşluğun üzerine yerelleştirir belirleyebilirsiniz. Ancak, bu tekniğin konvansiyonel ışık mikroskoplar çözünürlük sınırları ve değişken yönlendirmesi slayt15bakteri nedeniyle zorlu Imaging yapabilirsiniz bakteriler, küçük boyutu ve çubuk şeklinde ile sınırlıdır.
Gelişmiş görsel olarak fluorescently etiketli peptid yerelleştirme desenleri confocal mikroskobu kullanarak etkinleştirmek için sunulan Yöntem hedefidir. Görselleştirme gelişmiş küçük, ince, çubuk şekilli gram-negatif Escherichia coli (e.coli) ve gram-pozitif Bacillus megaterium (B. megaterium) kapatarak genişlemiş, küresel formları içine bakteri olarak anılacaktır spheroplasts (için gram-negatif suşları) ve önceki (için gram-pozitif suşları)16,17,18,19,20,21. Artan büyüklükleri ve bir bakteri yönünü bir slaytta, görüntüleme için alakasız yapar simetrik şekilleri nedeniyle spheroplasts ve önceki görüntü için daha kolay olur. Buna ek olarak, biz kantitatif amper yerelleştirme veya translocating her iki membran karakterize için confocal mikroskobu verileri çözümlemek için sistematik bir yaklaşım sunuyoruz. Bu yöntemler uygulamak ayırt etmek fluorescently peptid yerelleştirme desenleri etiketli kolaylaştırır. Burada sunulan protokolleri membran-aktif ajanlar amper hücre penetran peptidler de dahil olmak üzere dışında çeşitli lokalizasyonu değerlendirmek için kullanılabilir.
Bir avantaj bu tekniğin bu hücre hücre heterojenite15, aksine tanımlamak için yaygın olarak kullanılan diğer floresans deneyleri gösterebilir bir tek hücre düzeyinde anlayışlar amper etki mekanizması sağlar eylem yalnızca sağlar toplu tahminleri9,22,23,24,25amper mekanizmaları. Hücre girişini, lipid veziküller24gibi değerlendirmek için kullanılan diğer modellere kıyasla daha fizyolojik ilgili15 oldukları için spheroplasts ve AMP hücre girişini değerlendirmek için önceki belirli yararlı26 yaşında.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan protokolleri genişlemiş, küresel bakteri bulun, yönlendirmek ve görüntü çok daha kolay olduğundan daha büyük örnek boyutları bakteriyel görüntülerin daha hızlı elde etmek araştırmacılar için uygun olun. Birkaç açıdan değerli, veri toplamak için geliştirilmiş bu yeteneğidir. İlk olarak, peptid yerelleştirme desen daha sistematik bir kantitatif analiz sağlar. Nitel eğilimleri daha küçük görüntüleri kümelerinden göstermiş olabilir iken, yüksek-nitelik imge sadece b?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Araştırma Ulusal Enstitüsü alerji ve enfeksiyon hastalıkları (NIH-NIAID) ödülü R15AI079685 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Trizma hydrocloride (Tris HCl) | Sigma | T3253 | |
| Trizma base (Tris OH) | Sigma | T1503 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | 106361 | Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement |
| Cephalexin hydrate | Sigma | C4895 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| BBL Trypticase soy broth | Fisher Scientific | B11768 | |
| BF2 P11A FITC | NeoScientific | Custom ordered | |
| di-8-ANEPPS | Biotium | 61012 | |
| DMSO | Sigma | 34869 | Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane | Pall Corporation | 4192 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 II | For image acquisition |
| Leica Application Suite, Advanced Fluorescence | Leica Microsystems | For image processing |
References
- Baltzer, S. A., Brown, M. H. Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics. Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20 (4), 228-235 (2011).
- Hancock, R. E., Sahl, H. G. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nature Biotechnology. 24 (12), 1551-1557 (2006).
- Jenssen, H., Hamill, P., Hancock, R. E. Peptide antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews. 19 (3), 491-511 (2006).
- Toke, O. Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections. Biopolymers. 80 (6), 717-735 (2005).
- Wang, G., et al. Antimicrobial peptides in 2014. Pharmaceuticals. 8 (1), 123-150 (2015).
- Epand, R. M., Vogel, H. J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim Biophys Acta. 1462, 11-28 (1999).
- Drin, G., Rousselle, C., Scherrmann, J. -. M., Rees, A. R., Temsamani, J. Peptide Delivery to the Brain via Adsorptive-Mediated Endocytosis: Advances With SynB Vectors. AAPS PharmSciTech. 4 (4), 61-67 (2002).
- Splith, K., Neundorf, I. Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa. European Biophysics Journal. 40 (4), 387-397 (2011).
- Bustillo, M. E., et al. Modular analysis of hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide consisting of membrane translocating and membrane permeabilizing fragments. Biochim Biophys Acta. 1838 (9), 2228-2233 (2014).
- Koo, Y. S., et al. Structure-activity relations of parasin I, a histone H2A-derived antimicrobial peptide. Peptides. 29 (7), 1102-1108 (2008).
- Libardo, M. D., Cervantes, J. L., Salazar, J. C., Angeles-Boza, A. M. Improved bioactivity of antimicrobial peptides by addition of amino-terminal copper and nickel (ATCUN) binding motifs. ChemMedChem. 9 (8), 1892-1901 (2014).
- Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of Action of the Antimicrobial Peptide Buforin II: Buforin II Kills Microorganisms by Penetrating the Cell Membrane and Inhibiting Cellular Functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 253-257 (1998).
- Park, C. B., Yi, K. -. S., Matsuzaki, K., Kim, M. S., Kim, S. C. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8245-8250 (2000).
- Pavia, K. E., Spinella, S. A., Elmore, D. E. Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1818 (3), 869-876 (2012).
- Wei, L., LaBouyer, M. A., Darling, L. E., Elmore, D. E. Bacterial Spheroplasts as a Model for Visualizing Membrane Translocation of Antimicrobial Peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (10), 6350-6352 (2016).
- Chassy, B. M., Giuffrida, A. Method for the Lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme. Appl. Environ. Microbiol. 39 (1), 153-158 (1980).
- Fitz-James, P. C. Cytological and Chemical Studies of the Browth of Protoplasts of Bacillus megaterium. J. Biophysic. and Biochem. Cytol. 4 (3), 257-266 (1958).
- Martinac, B., Buechner, M., Delcour, A. H., Adler, J., Kung, C. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 2297-2301 (1986).
- Martinac, B., Rohde, P. R., Cranfield, C. G., Nomura, T. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Methods Mol Biol. 966, 367-380 (2013).
- Nadeau, J. L. . Introduction to Experimental Biophysics: Biological Methods for Physical Scientists. , (2016).
- Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Physical properties of Escherichia coli spheroplast membranes. Biophysical Journal. 107 (9), 2082-2090 (2014).
- Branco, P., Viana, T., Albergaria, H., Arneborg, N. Antimicrobial peptides (AMPs) produced by Saccharomyces cerevisiae induce alterations in the intracellular pH, membrane permeability and culturability of Hanseniaspora guilliermondii cells. Int J Food Microbiol. 205, 112-118 (2015).
- Kobayashi, S., et al. Membrane Translocation Mechanism of the Antimicrobial Peptide Buforin 2. Biochimie. 43 (49), 15610-15616 (2004).
- Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. J Vis Exp. (59), e3571 (2012).
- van der Kraan, M. I., et al. Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin. Peptides. 25 (2), 177-183 (2004).
- Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Biophys J. 111 (1), 132-139 (2016).
- Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II. Peptides. 32 (4), 677-682 (2011).
- Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor. Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).
- Decad, G. M., Nikaido, H. Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall. J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), E303-E310 (2015).
- Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes. Biophys J. 114 (2), 368-379 (2018).
- Ruthe, H. J., Adler, J. Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields. Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).
