Produção e visualização de Spheroplasts bacterianas e protoplastas para caracterizar a localização de peptídeo antimicrobiano
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para produzir Gram-negativas Escherichia coli (e. coli) spheroplasts e Gram-positiva Bacillus megaterium (b. megaterium) protoplastas claramente Visualizar e caracterizar rapidamente interações de peptídeo-bactérias. Isso fornece um método sistemático para definir membrana localizando e se peptídeos.
Abstract
O uso da microscopia confocal como um método para avaliar padrões de localização de peptídeo dentro bactérias comumente é inibido nos limites de resolução de microscópios de luz convencionais. Como a resolução de um microscópio de determinado não pode ser facilmente reforçada, apresentamos os protocolos para transformar a pequena bacilares Gram-negativas Escherichia coli (e. coli) e Gram-positiva Bacillus megaterium (b. megaterium) em formas esféricas maiores, facilmente imagens chamado spheroplasts ou protoplastas. Esta transformação permite que os observadores rapidamente e claramente determinar se peptídeos apresentar-se na membrana bacteriana (ou seja, localização de membrana) ou atravessam a membrana para entrar na célula (ou seja, se). Com esta abordagem, também apresentamos um método sistemático de caracterização de peptídeos como membrana localizando ou se. Enquanto este método pode ser usado para uma variedade de peptídeos de membrana-ativo e cepas bacterianas, demonstramos a utilidade do presente protocolo, observando a interação de Buforin II P11A (BF2 P11A), um peptídeo antimicrobiano (AMP), com e. coli SPHEROPLASTS e b. megaterium protoplastas.
Introduction
Peptídeos antimicrobianos (AMPs) ganharam atenção devido ao seu potencial uso como alternativas para os antibióticos convencionais1,2,3,4,5. Amplificadores de matam as bactérias, ou se através da membrana celular e interagindo com componentes intracelulares, como os ácidos nucleicos ou por permeabilizing da membrana, causando vazamento de célula conteúdo6. Além de sua utilização como antibióticos, se AMPs pode ser adaptado para aplicações de entrega de drogas porque interrupções podem atravessar a membrana impermeável7,8. Nós, portanto, procurar compreender mecanismos fundamentais de AMP de ação para estabelecer as bases para a sua utilização em design de drogas.
Microscopia confocal oferece uma forma de avaliar os padrões de localização de AMPs fluorescente etiquetadas em células bacterianas, fornecendo insights sobre seu mecanismo de ação9,10,11,12, 13 , 14. através da marcação da membrana da bactéria, um pode determinar se um peptídeo fluorescente etiquetado localiza a membrana ou espaço intracelular de uma célula bacteriana. No entanto, esta técnica é limitada pelo pequeno tamanho e haste forma de bactérias, que pode tornar a imagem desafiadora devido os limites de resolução dos microscópios de luz convencionais e a variável orientação das bactérias no slide15.
O objetivo do método apresentado é permitir melhorar a visualização dos padrões fluorescente etiquetadas peptídeo localização utilizando microscopia confocal. Visualização é reforçada pelo pequeno, magro, em forma de haste Gram-negativas Escherichia coli (e. coli) ligando e desligando o Gram-positiva Bacillus megaterium (b. megaterium) bactérias em formas esféricas, alargadas referido como SPHEROPLASTS (por cepas de bactérias Gram-negativas) e protoplastas (para cepas Gram-positivas)16,17,18,19,20,21. SPHEROPLASTS e protoplastas são mais fáceis de imagem devido à sua forma simétrica, o que torna a orientação de uma bactéria em um slide, irrelevante para a sua imagem e seu tamanho aumentado. Além disso, apresentamos uma abordagem sistemática para analisar quantitativamente dados de microscopia confocal para caracterizar AMPs como qualquer membrana localizando ou se. Aplicar esses métodos torna mais fácil distinguir fluorescente etiquetado padrões de localização de peptídeo. Os protocolos aqui apresentados podem ser usados para avaliar a localização de uma variedade de agentes de membrana-ativo diferente de AMPs, incluindo peptídeos penetra no celular.
Uma vantagem desta técnica é que ele fornece insights sobre o mecanismo de ação dos amplificadores em um nível de célula única, que pode revelar a heterogeneidade de célula para célula15, ao contrário de outros ensaios de fluorescência comumente usado para identificar o mecanismos de ação dos amplificadores, que fornecem apenas em massa estimativas9,22,23,24,25. O uso de spheroplasts e protoplastas para avaliar a entrada de celular AMP é especial útil26 porque eles são fisiologicamente mais relevantes15 do que outros modelos utilizados para avaliar a entrada da pilha, tais como de vesículas lipídicas24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os protocolos aqui apresentados torná-lo viável para os investigadores mais rapidamente obter maiores tamanhos de amostra de imagens bacterianas porque as bactérias alargadas, esféricas são mais fáceis de localizar, orientar e da imagem. Melhorada a capacidade de coletar dados é valiosa em vários aspectos. Em primeiro lugar, permite uma análise quantitativa mais sistemática dos padrões de localização de peptídeo. Enquanto tendências qualitativas podem ser demonstradas de pequenos conjuntos de imagens, apen…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Pesquisa foi apoiada pelo Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas (NIAID-NIH) prêmio R15AI079685.
Materials
| Trizma hydrocloride (Tris HCl) | Sigma | T3253 | |
| Trizma base (Tris OH) | Sigma | T1503 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | 106361 | Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement |
| Cephalexin hydrate | Sigma | C4895 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| BBL Trypticase soy broth | Fisher Scientific | B11768 | |
| BF2 P11A FITC | NeoScientific | Custom ordered | |
| di-8-ANEPPS | Biotium | 61012 | |
| DMSO | Sigma | 34869 | Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane | Pall Corporation | 4192 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 II | For image acquisition |
| Leica Application Suite, Advanced Fluorescence | Leica Microsystems | For image processing |
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