Une plate-forme de Microphysiologic pour la graisse humaine : en sandwich le tissu adipeux blanc
Summary
Le tissu adipeux blanc (WAT) a des lacunes critiques dans ses modèles actuels de la culture primaire, qui entravent le développement pharmacologique et études métaboliques. Nous présentons ici un protocole visant à produire un système adipeux microphysiological par WAT intercaler entre deux feuilles de cellules stromales. Cette construction fournit une plateforme stable et adaptable pour la culture primaire de WAT.
Abstract
Le tissu adipeux blanc (WAT) joue un rôle crucial dans la régulation du poids et tous les jours de la santé. Néanmoins, il y a des limites importantes aux modèles disponibles culture primaire, qui n’ont pas fidèlement récapituler le microenvironnement adipeux ou prolonger la viabilité WAT au-delà de deux semaines. L’absence d’un modèle de culture primaire fiable entrave gravement recherche dans WAT du métabolisme et du développement des médicaments. À cette fin, nous avons utilisé des normes NIH d’un système de microphysiologic pour développer une nouvelle plate-forme pour la culture primaire de WAT appelée « SWAT » (sandwich le tissu adipeux blanc). Nous surmontons la flottabilité naturelle des adipocytes en intercalant hachées WAT grappes entre feuilles de cellules stromales dérivées d’adipeux. Dans cette construction, les échantillons WAT sont viables sur huit semaines de culture. SWAT maintient l’ECM intact, contacts cellule-cellule et les pressions physiques in vivo le conditions de WAT ; en outre, SWAT maintient un profil transcriptionnel robuste, sensibilité à la signalisation chimique exogène et fonction de tissus entiers. SWAT représente une méthode simple, reproductible et efficace de culture de tissu adipeuse primaire. Potentiellement, c’est une plateforme largement applicable pour la recherche en physiologie, physiopathologie, métabolisme et développement pharmaceutique WAT.
Introduction
Le tissu adipeux est le principal organe de l’obésité, qui transporte les coûts médicaux annuels directs entre $ 147 milliards et $ 210 milliards dans l’US1. L’accumulation de tissu adipeux contribue également à d’autres causes principales de décès comme les maladies cardiaques, diabète de type II et certains types de cancer2. Modèles de culture in vitro sont essentiels pour les études du métabolisme et le développement de médicaments, mais les modèles actuels de recherche du tissu adipeux ont des lacunes majeures. Les adipocytes sont fragiles, flottant et différencient en phase terminale des cellules qui ne peut pas adhérer aux plastiques de culture cellulaire et par conséquent ne peuvent pas être cultivées à l’aide de méthodes de culture cellulaire conventionnel. Depuis les années 1970, plusieurs méthodes ont été utilisés dans les tentatives pour surmonter ces obstacles, y compris l’utilisation de lamelles de verre, plafond culture, culture en suspension et matrices extracellulaires3,4,5, 6 , 7. Toutefois, ces méthodes ont été marquées par la mort cellulaire et la dédifférenciation, et ils sont généralement utilisés pour pas plus d’une période d’étude de deux semaines. En outre, ces modèles ne pas récapituler le microenvironnement adipeux natif car ils ne conservent pas l’ECM intact, les interactions entre les adipocytes et stromales soutiennent les cellules, ni les cellules contractiles forces exercent les uns des autres en in vivo WAT.
En l’absence d’une méthode de culture de tissu adipeux primaire étalon-or, recherche adipeuse s’est appuyé principalement sur les pré-adipocytes différenciés (diffAds). DiffAds sont multiloculaire, adhérente et métaboliquement actives. En revanche, les adipocytes blancs primaires sont uniloculaires, non adhérentes et démontrent métabolisme relativement faible. L’échec des modèles actuels de culture de tissu adipeux à récapituler la physiologie des tissus sains d’adipeux mature est probablement un facteur important en l’absence de médicaments approuvés par la FDA qui ciblent directement les adipocytes. En fait, le manque de modèles d’organe physiologique in vitro est un problème majeur dans la plupart des organes et des maladies.
Dans son document annonçant la création de son programme de Microphysiological Systems (MPS), le National Institutes of Health (NIH) ont indiqué que le taux de réussite de 2013 à travers tous les essais cliniques pharmaceutiques humains était seulement 18 % pour la phase II et 50 % pour la phase III essais cliniques8. Le programme MPS est conçu pour traiter directement de l’incapacité de in vitro de la monoculture de la physiologie humaine modèle. Le NIH définit MPSs comme les systèmes de culture composés des humains primaires ou de cellules souches dans des constructions 3D multicellulaires qui récapitulent le fonctionnement des organes. Contrairement aux modèles réductionnistes de cultures de cellules immortalisées, homogène, MPSs devraient modeler exactement cellules, cellules drogue, médicamenteuses et orgue-drug interactions9. À la différence des méthodes de culture primaire à court terme, normes NIH dictent durabilité MPS pendant 4 semaines dans la culture8. On trouvera plus de détails sur le programme MPS à la NIH ad (#RFA-TR-18-001)10.
Nous avons développé un roman simple, adaptable, et peu coûteux MPS adipeuse appelé « en sandwich le tissu adipeux blanc » (SWAT)11. Nous avons surmonté la flottabilité naturelle des adipocytes en « sandwich » haché primaire tissu adipeux entre les feuilles des cellules stromales dérivées d’adipeux (ADSCs) (Figure 1). La construction 3D résultante récapitule le contact de cellule-cellule et le microenvironnement adipeux natif en entourant les adipocytes matures avec une population de cellules de soutien naturel adipocyte. SWAT a été validé en démontrant la viabilité de 8 semaines, réponse à exogène de signalisation, sécrétion adipokine et greffe dans un modèle animal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole détaille l’utilisation de ADSCs pour “sandwich” humain le tissu adipeux blanc ; lignées de cellules humaines ADSC peuvent être isolées par l’intermédiaire des protocoles bien établis,15. Toutefois, le système peut être adapté pour les besoins de recherche individualisée (comme l’utilisation de cellules 3T3L-1 pour la souris “sandwich” WAT). Ce processus implique la manipulation des tissus humains primaires. Les précautions standard devraient être utilisées ; manip…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à souligner le soutien institutionnel de LSU Health Sciences Center, qui a financé le projet.
Materials
| 10x HBSS | Thermofisher | 14185052 | |
| Gelatin | Sigma-aldrich | G9391 | |
| Collagenase | Sigma-aldrich | C5138 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995065 | |
| M199 Media | Thermofisher | 11043023 | Phenol red-free |
| 250µm Mesh Filter | Pierce | 87791 | |
| 0.2µm Syringe Filter | Celltreat | 229747 | |
| 5mL Luer-Lok syringes | BD | 309646 | |
| Metal Washers | These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3g | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heated Equipment | |||
| Incubated Orbital Shaker | VWR | 10020-988 | Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion |
| Heat Block | Set to 37-40°C and placed under Biosafety Cabinet | ||
| Water Bath | Set to ~75°C | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specialized Plastics | |||
| Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell | Nunc | 174902 or 174901 | These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6cm for 6cm dish, <3.5cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6cm dish, 5.1g for 6-well plate |
| Plastic Plunger Apparatus | These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics |
References
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