Rilevamento di localizzazione sottocellulare della proteina di verde fluorescenza della proteina Tagging e 4', 6-Diamidino-2-phenylindole macchiatura in Caenorhabditis elegans
Summary
Questo protocollo viene illustrato come monitorare una traslocazione nucleare della proteina sotto stress da calore utilizzando una proteina di fusione di fluorescenza verde protein (GFP) come indicatore e 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) colorazione. Il protocollo di colorazione DAPI è veloce e preserva i segnali di localizzazione sottocellulare della proteina e GFP.
Abstract
In questo protocollo, una proteina di fusione di fluorescenza verde protein (GFP) e 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) colorazione vengono utilizzati per tenere traccia delle modifiche di localizzazione sottocellulare della proteina; in particolare, una traslocazione nucleare sotto un caldo sottolineare condizione. Le proteine reagiscono segnali corrispondentemente a interni ed esterni. Un meccanismo comune è quello di cambiare la sua localizzazione subcellulare. Questo articolo descrive un protocollo per tenere traccia di localizzazione della proteina che non richiede un anticorpo, etichettatura radioattivo o un microscopio confocale. In questo articolo, GFP consente di contrassegnare la proteina bersaglio EXL-1 in c. elegans, un membro della famiglia di proteine (CLICs) dei canale intracellulare cloruro, compresi mammiferi CLIC4. Una linea transgenica integrato traslazionale exl-1::gfp (con un promotore e una sequenza genica completo) nasce dalla trasformazione e γ-radiazione e stabilmente esprime il gene e la gfp. Recenti ricerche hanno dimostrato che al momento lo stress da calore, non ossidativo, EXL-1::GFP si accumula nel nucleo. Sovrapposizione del segnale GFP con sia la struttura di nuclei e il DAPI segnali conferma i cambiamenti di localizzazione subcellulare EXL-1 sotto stress. Questo protocollo presenta due metodi di fissazione diversi per colorazione DAPI: fissazione dell’etanolo e acetone fissazione. Il protocollo di colorazione DAPI presentato in questo articolo è veloce ed efficiente e conserva sia il segnale GFP e i cambiamenti di localizzazione sottocellulare della proteina. Questo metodo richiede solo un microscopio a fluorescenza con Nomarski, un filtro FITC e un filtro DAPI. È adatto per un ambiente piccolo laboratorio, la ricerca di studente universitario, ricerca degli studenti di liceo e aule di biotecnologie.
Introduction
Un cambiamento della localizzazione sottocellulare della proteina è un meccanismo comune in risposta ai segnali interni o esterni come lo stress da calore, fame, stress ossidativo, apoptosi, fosforilazione della proteina e altri. Ad esempio, lo stress da calore induce un membro FOXO DAF-16 traslocazione nucleare1,2e la proteina BCL-2 pro-apoptotica che Bid trasloca i mitocondri ricevente morte segnalazione3,4. Esistono diverse tecniche rilevare queste modifiche. Una combinazione di western blotting e biochimicamente isolare strutture subcellulari (ad es., i mitocondri o i nuclei) ben potrebbe raggiungere l’ obiettivo3. Tuttavia, esso richiede un anticorpo specifico contro la proteina di interesse. Così, un anticorpo consolidato diventa la chiave per il successo. Un approccio alternativo è quello di etichettare diverse strutture subcellulari o organelli con i vari indicatori quali proteina di fluorescenza verde (GFP), proteina di fluorescenza rossa (RFP), proteina di fluorescenza gialla (YFP) e mCherry e nel frattempo etichettare la proteina di interesse con altri marcatori. Poi, li osserviamo al microscopio confocale per localizzare i bersagli5,6. Gli isotopi radioattivi sono una scelta alternativa per l’etichettatura di proteine bersaglio e quindi rilevare la loro localizzazione subcellulare7. Tuttavia, questo metodo richiede un’adeguata formazione e gestione delle scorie radioattive. In circostanze come la mancanza di un anticorpo specifico, l’assenza di un indicatore adeguato, o della scarsità di attrezzature come un microscopio confocale, un approccio alternativo deve essere considerato. Per identificare una traslocazione nucleare della proteina, è attraente solo contrassegnare proteine bersaglio con un pennarello e macchia i nuclei con il reagente chimico 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) poiché questo richiede solo un microscopio a fluorescenza regolari.
Immunolabeling di c. elegans con anticorpi è impegnativo a causa della bassa permeabilità del guscio d’uovo o la cuticola collagena che circonda l’animale. Nel frattempo, dato che le proteine di c. elegans sono significativamente divergenti da loro ortologhi di vertebrati, alcune aziende commerciali forniscono c. elegans con prodotti specifici. È difficile per un piccolo laboratorio generare anticorpi di c. elegans per se stessi. Ricercatori della comunità spesso utilizzano proteine etichettate come marcatori per illustrare un’espressione di gene o localizzazione della proteina. In questo articolo utilizza EXL-1::GFP ad esempio per tenere traccia di una traslocazione nucleare della proteina sotto lo stress di calore8. Un integrato traslazionale exl-1::gfp nel genoma animale viene utilizzata per esprimere stabilmente il gene con la fusione di gfp . La ricerca ha indicato che exl-1 è espresso nell’intestino, parete del corpo muscolare e altre strutture subcellulari8. Questo protocollo viene illustrato come sincronizzare i vermi per il quarto stadio larvale (L4), eseguire una fissazione dell’etanolo esperimento e la condotta DAPI macchiatura, di calore lo stress, fissazione di acetone e imaging sotto un microscopio a fluorescenza regolari.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo presenta un metodo veloce ed efficiente per verificare cambiamenti sottocellulare della proteina dal citoplasma al nucleo. L’espressione della proteina è stata indicata da una fusione di GFP, mentre la struttura di nucleo è stata verificata da DAPI macchiatura (Figura 3). Dato che immunostaining proteine di c. elegans è impegnativo, la maggior parte localizzazione cellulare della proteina di c. elegans sono caratterizzati da loro tagging con le proteine m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I ceppi di c. elegans utilizzati in questo studio sono stati ottenuti dal centro Caenorhabditis genetica, che è sostenuto dal National Institutes of Health – ufficio programmi delle infrastrutture di ricerca (P40 OD010440). Questo lavoro è stato supportato da NIH: 1R03AG048578-01 Jun Liang, CUNY-CCRG 1501-Jun Liang e PSC-CUNY 66184-00 44 e 45 67248-00 a Jun Liang. Grazie Cathy Savage-Dunn per gentilmente condividere il suo spazio di laboratorio. Tutte le immagini di fluorescenza sono stati raccolti a Queens College Core Facility. Ringraziamo William J. Rice per i suoi commenti sul manoscritto.
Materials
| DAPI | Biotium | 40043 | both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well |
| OP50 | CGC | OP50 | https://cgc.umn.edu/ |
| Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | ||
| Kim Wipe | Kimberly-Clark Corporation | soft tissue | |
| Zeiss AX10 | Zeiss | fluorescence microscope | |
| Axiovision Rel 4.8 | Zeiss | microscope software | |
| AxioCam MR Rev3 | Zeiss | digital camera | |
| Incubator | |||
| Micro centrifuge | |||
| Transparent nail polish gel | |||
| 60 mm petri dishes | |||
| Glass slides | |||
| Glass coverslips | |||
| 1-20 µL pipettor | |||
| 20-200 µL pipettor | |||
| 200-1000 µL pipettor | |||
| 1-200 µL pipet tips | |||
| 200-1000 µL pipet tips | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Platinum wire worm pick |
References
- Essers, M. A., et al. FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNK. The EMBO Journal. 23 (24), 4802-4812 (2004).
- Oh, S. W., et al. JNK regulates lifespan in Caenorhabditis elegans by modulating nuclear translocation of forkhead transcription factor/DAF-16. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (12), 4494-4499 (2005).
- Gross, A., et al. Caspase cleaved BID targets mitochondria and is required for cytochrome c release, while BCL-XL prevents this release but not tumor necrosis factor-R1/Fas death. The Journal of Biological Chemistry. 274 (2), 1156-1163 (1999).
- Doerflinger, M., Glab, J. A., Puthalakath, H. BH3-only proteins: a 20-year stock-take. The FEBS Journal. 282 (6), 1006-1016 (2015).
- Mayorova, T. D., et al. Cells containing aragonite crystals mediate responses to gravity in Trichoplax adhaerens (Placozoa), an animal lacking neurons and synapses. PLoS One. 13 (1), e0190905 (2018).
- Terron-Camero, L. C., Molina-Moya, E., Sanz-Fernandez, M., Sandalio, L. M., Romero-Puertas, M. C. Detection of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) during hypersensitive cell death. Methods in Molecular Biology. , 97-105 (2018).
- Pedrazzini, E., Vitale, A. Protein biosynthesis and maturation in the ER. Methods in Molecular Biology. , 179-189 (2018).
- Liang, J., Shaulov, Y., Savage-Dunn, C., Boissinot, S., Hoque, T. Chloride intracellular channel proteins respond to heat stress in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (9), e0184308 (2017).
- Evans, T. C. Transformation and microinjection. Wormbook. , (2006).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
- Yochem, J. Nomarski images for learning the anatomy, with tips for mosaic analysis. Wormbook. , (2006).
- Dulhunty, A., Gage, P., Curtis, S., Chelvanayagam, G., Board, P. The glutathione transferase structural family includes a nuclear chloride channel and a ryanodine receptor calcium release channel modulator. The Journal of Biological Chemistry. 276 (5), 3319-3323 (2001).
- Suh, K. S., Malik, M., Shukla, A., Yuspa, S. H. CLIC4, skin homeostasis and cutaneous cancer: surprising connections. Molecular Carcinogenesis. 46 (8), 599-604 (2007).
- Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M., Kong, B. CLIC4 mediates TGF-beta1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer. Oncology Reports. 22 (3), 541-548 (2009).
- Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Edwards, J. C., Petersen, O. W. Differential expression of a chloride intracellular channel gene, CLIC4, in transforming growth factor-beta1-mediated conversion of fibroblasts to myofibroblasts. The American Journal of Pathology. 161 (2), 471-480 (2002).
- He, G., et al. Role of CLIC4 in the host innate responses to bacterial lipopolysaccharide. European Journal of Immunology. 41 (5), 1221-1230 (2011).
- Zhong, J., et al. Inhibition of CLIC4 enhances autophagy and triggers mitochondrial and ER stress-induced apoptosis in human glioma U251 cells under starvation. PLoS One. 7 (6), e39378 (2012).
- Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130 (26), 6453-6464 (2003).
- Leopold, L. E., Heestand, B. N., Seong, S., Shtessel, L., Ahmed, S. Lack of pairing during meiosis triggers multigenerational transgene silencing in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), E2667-E2676 (2015).
- Schultz, R. D., Bennett, E. E., Ellis, E. A., Gumienny, T. L. Regulation of extracellular matrix organization by BMP signaling in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9 (7), e101929 (2014).
- Matus, D. Q., et al. Invasive cell fate requires G1 cell-cycle arrest and histone deacetylase-mediated changes in gene expression. Developmental Cell. 35 (2), 162-174 (2015).
- Reddy, K. C., Villeneuve, A. M. C. elegans HIM-17 links chromatin modification and competence for initiation of meiotic recombination. Cell. 118 (4), 439-452 (2004).
- Ames, K., et al. A non-cell-autonomous role of BEC-1/BECN1/Beclin1 in coordinating cell-cycle progression and stem cell proliferation during germline development. Current Biology. 27 (6), 905-913 (2017).
- Pekar, O., et al. Linking the environment, DAF-7/TGFbeta signaling and LAG-2/DSL ligand expression in the germline stem cell niche. Development. 144 (16), 2896-2906 (2017).
- Schvarzstein, M., et al. DNA helicase HIM-6/BLM both promotes MutSgamma-dependent crossovers and antagonizes MutSgamma-independent interhomolog associations during caenorhabditis elegans meiosis. Génétique. 198 (1), 193-207 (2014).
- Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).
- Nagamatsu, Y., Ohshima, Y. Mechanisms for the control of body size by a G-kinase and a downstream TGFbeta signal pathway in Caenorhabditis elegans. Genes to Cells. 9 (1), 39-47 (2004).
