Differenza di potenziale nasale per quantificare il trasporto Trans-epiteliale ionico in topi
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per misurare la differenza di potenziale nasale nei topi. Il test quantifica la funzione dei trasportatori transmembrana di ioni come il regolatore di conduttanza del transmembrane di fibrosi cistica e il canale epiteliale del sodio. È utile per valutare l’efficacia di nuove terapie per la fibrosi cistica.
Abstract
Il test di differenza potenziale nasale è stato utilizzato per quasi tre decenni per aiutare nella diagnosi di fibrosi cistica (CF). Ha dimostrato di essere utile nei casi di attenuato, forme oligo – o mono-sintomatici di CF solitamente diagnosticata tardi nella vita e dei disordini da CF come assenza congenita bilaterale dei vasi deferenti, pancreatite cronica idiopatica, allergica aspergillosi broncopolmonare e bronchiectasie. Nelle impostazioni sia cliniche e precliniche, il test è stato utilizzato come biomarcatore per quantificare le risposte di strategie terapeutiche mirate per adattamento cfr la prova di un mouse è impegnativo e può comportare una mortalità associata. Questo articolo descrive la profondità adeguata dell’anestesia necessaria per mantenere un catetere nasale in situ per la perfusione continua. Esso elenca le misure per evitare la Bronco-aspirazione di soluzioni irrorati nel naso. Descrive anche la cura degli animali alla fine del test, inclusa l’amministrazione di una combinazione di antidoti dei farmaci anestetici, che conduce rapidamente invertendo l’anestesia con il recupero completo degli animali. Dati rappresentativi ottenuti da un CF e uno spettacolo di selvaggio-tipo mouse che il test discrimina tra CF e non CF. Complessivamente, il protocollo qui descritto consente misurazioni affidabili della condizione funzionale di trasportatori trans-epiteliale di cloruro e sodio nei topi di respirare spontaneamente, nonché prove multiple nello stesso animale, riducendo relative ai test mortalità.
Introduction
Per quasi tre decenni, electrical potenziali misure di differenza (PD) sono state utilizzate per valutare lo stato funzionale dei trasportatori ionici transmembrana espressa a mucosa nasale, come rappresentante del vie aeree distali1. Come una dinamica multistep prova2,3, nasale PD consente una dissezione funzionale del regolatore di conduttanza del Transmembrane fibrosi cistica (CFTR) ed epiteliale del sodio (ENaC) canale attività, entrambi localizzati alle membrane apicali di le cellule epiteliali ed esercitare ruoli critici in idratazione superficiale della via aerea. Le principale applicazione clinica del test PD nasale è di assistere nella diagnosi della fibrosi cistica, la malattia genetica mortale più comune nelle popolazioni caucasiche con un’incidenza media di 1 su 2.500 nascite nei paesi europei. Il test ha da tempo dimostrato utile nella diagnosi di forme attenuate, oligo – o mono-sintomatico della fibrosi cistica diagnosticata solitamente più tardi nella vita e dei disordini da CF come assenza congenita bilaterale dei vasi deferenti, pancreatite cronica idiopatica, allergica aspergillosi broncopolmonare e bronchiectasie4. Più recentemente, valutazione clinometrica della modulazione terapeutica di base canale CFTR difetto5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16 ha fatto uso del PD nasale in studi clinici di nuove terapie CF. In ambito preclinico, il test è stato adattato per il mouse17 per consentire indagini la bioattività del nuovo CF terapie target18,19,20,21. Nei topi, la tecnica è delicata, basato sulle differenze anatomiche relative specie nella dimensione della regione nasale tra roditori ed esseri umani e principalmente sul ruolo essenziale di input sensoriali dalla regione Solci in roditori. Richiede operatori qualificati e specializzati, apparecchiature dedicate e forniture.
CF è una malattia multi-sistemica delle ghiandole esocrine, in quale malattia respiratoria cronica domina il quadro clinico. La malattia è causata da mutazioni nel gene che codifica il monofosfato di adenosina ciclico (cAMP)-regolato cloruro CFTR canale22. Ad oggi, più di 2.000 mutazioni CFTR sono state identificate23. La più comune mutazione24,25, trovato in quasi il 90% degli alleli CF, corrisponde a un’eliminazione di fenilalanina in posizione 508 della catena polipeptidica della proteina (F508del-CFTR). La proteina CFTR è un canale del cloro di conduttanza piccolo puramente ohmico. C’è anche una notevole prova che CFTR regola altri meccanismi di trasporto, in particolare, ENaC26,27. Trasporto difettoso dell’elettrolito, compreso ridotta conduttanza di cloruro CFTR-dipendente e aumentata conduttanza di sodio ENaC-dipendente, è un segno distintivo del epithelia del CF. Il difetto ex viene riflessa da una ripolarizzazione ridotta o abolita in risposta a un efflusso cloruro gradiente elettrochimico che favorisce e l’aggiunta di isoprenalina (un agonista β-adrenergici che aumenta cAMP intracellulare) o forskolin (un adenilato agonista di ciclasi, non approvato per uso clinico). Il difetto di quest’ultimo si riflette un hyperpolarization basale della mucosa nasale (un PD più negativa) e una risposta aumentata di amiloride, un farmaco diuretico che blocca ENaC28.
Modelli murini CF sono stati usati frequentemente nella ricerca CF e sono stati preziosi in patologia CF di dissezione. Al giorno d’oggi, almeno quindici modelli sono stati descritti29, di cui tre sono omozigoti per il31,30,di mutazione F508del più clinicamente rilevante32. Uno di questi tre ceppi30, sviluppato all’Università Erasmus di Rotterdam, è stato utilizzato per quasi 20 anni in laboratorio Université catholique de Louvain (UCL). Il Cftrtm1Eur modello30 ha dimostrato di essere molto utile per studiare la patofisiologia multiorgan della malattia CF e per testare l’efficacia di nuove strategie terapeutiche18,19,20, 21. Numerosi problemi possono verificarsi durante o presto dopo (< 24h) il test di PD nasale nei topi. In questa carta, la profondità adeguata dell'anestesia richiesta per mantenere un catetere nasale in situ per aspersione continua e misure per evitare la Bronco-aspirazione di soluzioni irrorati nel naso sono descritti. La cura degli animali alla fine del test è descritta, compreso la gestione di una combinazione di antidoti di farmaci anestetici, che conduce rapidamente invertendo l’anestesia con il recupero completo degli animali. Complessivamente, queste procedure consentono misure affidabili in topi di respirare spontaneamente, ridotta mortalità relative ai test e ripetendo il test nello stesso animale. Dati rappresentativi ottenuti dal test PD nasale in un CF e in un selvaggio-tipo mouse sono mostrati e discussi.
Il protocollo di test PD nasale murino è segnalato in tre sessioni: valutazione e gestione prima, durante e dopo la prova. Nel pre-test di valutazione e gestione, il protocollo di preparazione del catetere a doppio lume nasale e delle soluzioni utilizzate per aspersione nasale continua è descritto dettagliatamente. Durante la valutazione e gestione porzioni del test, la messa a punto sperimentale e la gestione del mouse viene sezionato minuziosamente. Infine, gestione dell’animale alla fine del test è descritto per migliorare il recupero pieno animale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo scopo di questa carta è di descrivere un protocollo adeguato per misurare nasale PD sotto perfusione continua di soluzioni nei topi di respirare spontaneamente per un periodo di tempo necessario per verificare l’integrità dei trasportatori di ioni, principalmente CFTR ed ENaC. Tutti i passaggi del protocollo sono stati attentamente ottimizzati per garantire il recupero pieno animale e buona qualità e dati riproducibili. In particolari, critici i passaggi sono valutazione di anestesia e gestione adeguata posizione a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano la Prof. ssa J. Lebacq per l’editing criticamente il manoscritto. CFTRtm1Eur (topi omozigoti F508del-CFTR (FVB/129) sono stati sviluppati dalla Erasmus MC, Rotterdam, Paesi Bassi, con il sostegno della Comunità economica europea azione di coordinamento europeo per la ricerca in fibrosi cistica EU FP6 LHHM-CT-2005-018932.
Materials
| Portex polyethylene tube | Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL | Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD | to prepare capillary tubes for nasal probe |
| Electrode cream | Parker, Fairfield, NJ, USA | Redux cream | to build electrode bridges |
| Ag/AgCl electrodes | Biomedical, Clinton Township, MI, USA | JNS BNT131-1,0 | measuring and reference electrodes |
| amiloride hydrochloride | Sigma, St Louis, MI, USA | A7410 | to prepare perfusion solutions |
| forskolin | Sigma, St Louis, MI, USA | F6886 | to prepare perfusion solutions |
| Knick Portamess voltmeter | Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany | Portavo 904 pH | to measure potential difference |
| Paraly SW 112 Software | Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany | Paraly SW112 software | to capture potential difference data |
| midazolam | Mylan, Hoeilaart, Belgium | Dormicum 15mg/3ml | to serve as anaesthetic premedication |
| fentanyl | Janssen Cilag, Berchem, Belgium | Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| medetomidine | Orion Pharma, Espoo, Finland | Domitor 1 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| droperidol | Janssen Cilag, Berchem, Belgium | Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| clonidine | Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany | Catapressan 0.15 mg/ml, | to serve as anaesthetic medication |
| refernce IV catheter | Becton Dickinson, Sandy, UT, USA | 24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W | to build electrode bridges |
| forceps | Fine science Tools, Heidelberg, Germany | Dumont #5, Fine science Tools | to place the nasal catheter |
| naloxone | Braun Medical, Brussels, Belgium | Narcan, 0.4 mg/ml | to serve as anaesthetic antagonist |
| atipamezole | Zoetis, Bloomberg, Belgium | Antisedan, 5 mg/ml | to serve as a medetomedine specific antidote |
| Heating pads | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | 18,8×37,5 cm; 15,5×15,5 cm | to avoid hypothermia during and after the test |
| Peristaltic pump P1 | GE Life Sciences, Uppsala, Sweden | 18111091 | to perfuse solutions in the mouse nose |
| cyanoacrylate glue | Loctite, Henkel, Düsseldorf, Germany | super glue 3 | to glue together two capillary tubes for nasal probe |
| NaCl | Sigma, St Louis, MI, USA | RES0926S-A7 | Pharma-Grade, USP |
| CaCl2.2H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | M7304 | Pharma-Grade, USP |
| MgCl2.6H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | 1551128 | Pharma-Grade, USP |
| K2HPO4 | Sigma, St Louis, MI, USA | 1551139 | Pharma-Grade, USP |
| Na gluconate | Sigma, St Louis, MI, USA | S2054 | Pharma-Grade, USP |
| Ca gluconate | Sigma, St Louis, MI, USA | C8231 | Pharma-Grade, USP |
| MgSO4.7H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | RES0089M-A7 | Pharma-Grade, USP |
| BD needle | Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA | BD 26G (0.45×10 mm) | intraperitoneal injection |
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