Imaging FITC-dekstran som en Reporter regulert Exocytosis

Summary

Her detalj vi en metode for levende celle avbilding av regulert exocytosis. Denne metoden bruker FITC-dekstran, som akkumuleres i lysosome-relaterte organeller, som reporter. Denne enkle metoden kan også skille mellom ulike regulert exocytosis i celler som er vanskelige å manipulere genetisk.

Abstract

Regulert exocytosis er en prosess som slippes Last, som er lagret i sekretoriske granulater (SGs), som svar på en sekretoriske utløser. Regulert exocytosis er grunnleggende for intercellulære kommunikasjon og en viktig mekanisme for utskillelsen av nevrotransmittere, hormoner, inflammatoriske mediatorer og andre forbindelser, av en rekke celler. Minst tre forskjellige mekanismer er kjent for regulert exocytosis: full exocytosis, der en enkelt SG fullt sikringer med plasma membran, kyss-and-run exocytosis, der en enkelt SG transiently sikringer med plasma membranen, og sammensatte exocytosis, der flere SGs sikring med hverandre, før eller etter SG sammensmelting med plasma membranen. Typen regulert exocytosis foretas av en celle er ofte diktert av sekretoriske utløser. I mange celler, kan en enkelt sekretoriske utløse derimot aktivere flere driftsmoduser regulert exocytosis samtidig. Til tross for sine overflod og betydning over celletyper og arter er mekanismer som bestemmer forskjellige moduser sekresjon i stor grad uløst. En av de største utfordringene i undersøke forskjellige moduser regulert exocytosis, er vanskeligheten i skille mellom dem, i tillegg til å utforske dem separat. Her beskriver vi bruk av fluorescein isothiocyanate (FITC)-dekstran som exocytosis reporter, og levende celle imaging for å skille mellom forskjellige veier av regulert exocytosis, med fokus på sammensatte exocytosis, basert på robusthet og varighet for exocytic hendelser.

Introduction

Regulert exocytosis er den primære mekanismen som lett gjort Last frigis fra en sekretoriske celle som svar på en bestemt utløser. Lasten er før dannet og sequestered i sekretoriske blemmer, som det er lagret til en utløser videresender signalet for utgivelsen av SGs’ innhold. Forskjellige typer signaler kan resultere i forskjellige moduser av regulert exocytosis eller forskjellige moduser av regulert exocytosis oppstå samtidig. Tre viktigste formene for regulert exocytosis er kjent: full exocytosis, som innebærer full blanding av en enkelt sekretoriske granule med plasma membran; kyss-and-run exocytosis, som innebærer forbigående fusjon av det sekretoriske granulen med plasma membranen etterfulgt av sin gjenvinning; og sammensatte exocytosis, som er preget av homotypic blanding av flere SGs før (dvs., multigranular exocytosis) eller sekvensielle (dvs., sekvensielle exocytosis) til fusjon med plasma membranen¹. Sammensatte exocytosis regnes som den mest omfattende modusen av Last release², som gjør det mulig for rask utskillelsen av Last, inkludert fra SGs som ligger distale fra plasma membranen. Sammensatte exocytosis er dokumentert i begge exocrine og endokrine celler^{3,4,5,6,7,8,9}, samt immunceller. I immunceller, som eosinofile^10,11,12 og nøytrofile¹³, tillater sammensatte exocytosis rask og robust utgivelsen av meglere som kreves for å drepe invaderende patogener som bakterier eller parasitter. Mast celler (MCs) distribuere sammensatte exocytosis for effektiv utgivelsen av forhåndslagrede inflammatoriske mediatorer under medfødte immunreaksjoner, anafylaksi og andre allergiske reaksjoner^{14,15,16 , 17}. siden forskjellige moduser exocytosis oppstår samtidig^18,19, har det blitt en utfordring å skille mellom dem i sanntid eller til å identifisere deres respektive fusion machineries, derav Klargjørende deres underliggende mekanismene.

Her presenterer vi en metode basert på levende celle imaging cellen lastet FITC-dekstran, som gjør at sanntid sporing av exocytic hendelser og skille mellom deres forskjellige moduser. Spesielt tillater våre metoden eksklusive overvåking av sammensatte exocytosis.

FITC-dekstran er en komplekskonjugerte til pH-sensitive fluorophore FITC med Glukan polysakkarid dekstran. Fluorescently merket dextrans har vist inn i cellen av micropinocytosis^20,21 og macropinocytosis^22,23. Som endocytic rom eldre i lysosomer, har det vært vist at FITC-dekstran akkumuleres i lysosome uten tilsynelatende degradering. Men siden FITC er en svært pH-sensitive fluorophore²⁴, og lysosome-lumen er surt, slukker FITC-dekstran fluorescens på å nå lysosome²⁴. Dermed etablere dextrans som lysosome målrettet Last, tatt med pH følsomheten til FITC, har lagt grunnlaget for bruk av FITC-dekstran i studier av lysosome exocytosis^{25,26,27 , 28 , 29}.

Flere celletyper, inkludert MCs, nøytrofile, eosinofile, cytotoxic T-celler, melanosomes og andre, SGs lysosomale funksjoner og er klassifisert som lysosome-relaterte organeller (LROs) eller sekretoriske lysosomer^30,31 . Siden LROs har et surt luminal pH, kan FITC-dekstran brukes til å visualisere deres exocytosis, som følge av høyere pH knyttet til exteriorization av LROs. Faktisk, FITC-dekstran har blitt brukt til å overvåke exocytosis MCs^18,32,33. I denne metoden, er FITC-dekstran lagt til i cellekultur, tatt opp av cellene av pinocytosis og sortert i SGs. Som i lysosomer, er FITC fluorescens slukket i SGs når de er inne i cellen. Men på SG fusion med plasma membranen og påfølgende eksponering for eksterne miljøet gjenvinner FITC-dekstran sin fluorescens som SG pH stiger, tillater enkel sporing av exocytic hendelser av levende celle mikroskopi. Her justert vi denne metoden å aktivere unike sporing av sammensatte exocytosis.

To andre metoder har blitt brukt tidligere spore sammensatte exocytosis. Elektronmikroskop var den første metoden å karakterisere exocytic strukturer som foreslo forekomsten av forskjellige moduser av exocytosis. Spesielt ga observasjoner av “sekretoriske tunneler” i bukspyttkjertelen acinar celler³⁴ og MCs^35,36,37 opphav til hypotesen om sammensatte exocytosis. Men mens den høye oppløsningen av elektronmikroskop har makt til å avsløre smeltet blemmer, det kan ikke spore dynamikken i sin fusion og dermed kan ikke definere om de stemmer med SG fusion under sammensatte exocytosis eller blanding av inndekning av noe granulater etter deres endocytose. Denne hindringen er overvunnet i andre metoder som kan måle exocytosis i levende celler, som oppdateringen klemme målene av plasma membranen kapasitans^11,13,38,39 eller amperometry ⁴⁰ av media. Imidlertid oppdateringen clamping krever en spesiell oppsett og kan ikke være egnet for alle celletyper. Amperometry mål er kunne spore exocytosis bare hvis lasten er utgitt i umiddelbar nærhet til elektroden. Derfor tilbyr med levende celle imaging fordeler over disse metodene, som det ikke bare tillater for sanntid sporing av exocytosis, men det tillater rask og enkel henting av data fra hele cellen.

Sporing av FITC-dekstran av levende celle mikroskopi tilbyr også noen fordeler til andre levende celle imaging-baserte metoder. For eksempel er en brukte metoden totalt interne refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRFM) av celler lastet med en fluorescerende SG sonde eller uttrykke en fluorescerende protein-merket SG Last eller membran protein^{26,41, 42 , 43}. styrken i denne metoden ligger i dens evne til å overvåke utelukkende hendelser som oppstår nær plasma membranen (heretter referert til som fotavtrykk), derav exocytic hendelser. Men er dette også ulempen med denne metoden fordi bare cellen brøkdel er coverglass og nær mikroskop linsen kan være fotografert⁴⁴. Om slike fotavtrykk faktisk representerer hele cellemembranen overflaten er fortsatt diskuteres^45,46,47. I denne forbindelse, lar med en pH-sensitive fargestoff som FITC-dekstran og standard fluorescens mikroskop eller AC confocal mikroskop med en åpen pinhole avbilding av hele cellen, dermed tar totale exocytic hendelser som skjer i denne cellen.

Ekstra pH-sensitive journalister som brukes til å studere regulert exocytosis av hele cellen avbildning eller TIRFM inkluderer SG Last eller SG membran protein del phlourin, en pH-sensitive GFP variant. NPY – phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin og synapto-phluorin,^48,,^49,,^50,,^51,,⁵²eksempler. Mens uttrykket av disse sonder kan representere nærmere endogene sammensetningen av SGs, det medfører transfection cellene, og kan derfor være mindre egnet til celler som er vanskelig å transfect. Derfor, når studere celler som er vanskelig å transfect eller under eksperimentelle forhold som krever flere genomisk manipulasjoner, bruk av et stoff som du kan bare legge til celle kultur medium, for eksempel FITC-dekstran, er en fordel . FITC-dekstran tilbyr også en fordel over Akridin oransje (AO), en annen pH-sensitive fargestoff som har blitt brukt for sporing av exocytosis av levende celle mikroskopi^{53,54,55,56 , 57 , 58}. AO har vist seg å indusere photolysis av blemmer som resulterer i USANN blinker, som ikke samsvarer med faktiske sekresjon behandler²⁷. I kontrast, gjenspeiler FITC-dekstran bedre sekresjon hendelser, sannsynligvis på grunn av sin lave Foto-indusert produksjon av reaktive oksygen²⁷.

Spesielt, er en alternativ tilnærming for å studere exocytosis ved å spore tilstrømningen av en farge, fra eksterne mediet i SG gjennom fusion pore som åpnes under denne prosessen. I dette tilfellet legges fargestoff til eksterne medium sammen med sekretoriske utløseren. Deretter, når fusion pore åpner, fargestoff diffunderer i SG^59,60. En klar fordel med denne metoden er at det også tilbyr muligheten til å beregne fusion porestørrelse, ved bruk av fargestoffer av variabel størrelse. For eksempel kan dextrans av ulike molekylvekt (MW), konjugert til ulike fluorophores, brukes som ekstracellulære fargestoffer der den maksimale størrelsen på dekstran som kan trenge SG skulle tilsvare størrelsen på fusion pore^{59, 61 , 62 , 63 , 64}. I tillegg denne tilnærmingen ikke krever bruk av en pH-sensitive sonde. Men er ulempe at signalet til støyforhold er svært lav, siden en stor mengde fargestoff er til stede i mediene under oppkjøpet av bildene i høye.

Bruk av FITC-dekstran som en markør for exocytosis overvinner samlet flere ulemper i tidligere rapportert metoder, som signal til støy forhold, toksisitet, dynamisk sporing og kompleksitet.

Her beskriver vi bruk av FITC-dekstran å overvåke sammensatte exocytosis i RBL – 2H 3 mast celle linje (heretter referert til som RBL, først og fremst etablert av Eccleston et al. ⁶⁵ og ytterligere klonet av Barsumian et al. ⁶⁶), svar på immunglobulin E (IgE) / antigen (Ag) aktivisering.

Protocol

1. forberedelser Utarbeidelse av RBL kultur medier Mix 500 mL av lav glukose Dulbecco endret Eagle’s medium (DMEM) med 56 mL av fetal bovin serum (FBS), 5,5 mL av penicillin streptomycin nystatin løsning, 5,5 mL av L-glutamin 200 mM løsning. Dette resulterer i lav glukose DMEM supplert med 10% FBS, 100 µg/mL streptomycin, 100 enheter/mL penicillin, 12 enheter/mL nystatin og 2 mM L-glutamin. Filtrere media ved å bruke filtere topp-vakuum 0.22 µm porestørrelse og butikk på 4 ° C. …

Representative Results

Figur 1a representerer skjematisk hvordan FITC-dekstran kan fungere som en reporter for regulert exocytosis og recapitulate forskjellige moduser exocytic hendelser. Først er celler ruges med FITC-dekstran, som er internalisert pinocytosis og til SGs. Siden SGs MCs LROs, deres lav pH demper fluorescens av FITC, vises her som svarte granulater (-vekselstrøm, jeg). Når cellene er utløst av et secretagogue og SGs sikringen med plasma membranen, dannes en fusi…

Discussion

Her beskriver vi hvordan sporing fluorescens av FITC-dekstran lastet inn SGs kan brukes til å fange spesielt sammensatt exocytosis hendelser. Dette ble oppnådd ved å sette mikroskop for å skaffe et bilde hvert 15 sekunder, slik at bare langvarig hendelser blir registrert over tid og dermed unntatt kort hendelser som skulle tilsvare full exocytosis eller kyss-and-run exocytosis. For å etablere metoden, viste vi at knockdown av Rab5 isoformene som uttrykkes i RBL celler, og er avgjørende for sammensatte exocytosis, e…

Materials

DMEM low glucose	Biological Inductries	01-050-1A
Fetal bovine serum	Gibco	12657
Pen-strep-nystatin solution	Biological Inductries	03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution	Biological Inductries	03-020-1A
FITC dextran 150K	Sigma-Aldrich	46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution B	Biological Inductries	03-052-1A	Warm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size	Sigma-Aldrich	CLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore size	Sartorius	16534K
Chambered coverglass	Thermo scientific	155411
Corning tissue-culture treated culture dishes	Sigma-Aldrich	CLS430167
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503
Anti-DNP monoclonal IgE	Sigma-Aldrich	D8406
DNP-HSA (Ag)	Sigma-Aldrich	A6661	Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4	Biological Inductries	03-025-1B
CaCl2	MERK	102382
Glucose	BDH Laboratories	284515V
Ammonium chloride	MERK	1145
PIPES dipotassium salt	Sigma-Aldrich	108321-27-3
Calcium acetate hydrate	Sigma-Aldrich	114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate)	Sigma-Aldrich	G1501
NaH2PO4	MERK	6346
NaCl	MERK	106404
MgCl2	MERK	105833
KCl	MERK	104936
Electroporator	BTX	ECM830
Confocal microscope, Zeiss	Zeiss	LSM 5 Pascal, Axiovert 200M	Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled airstream incubator
Confocal microscope, Zeiss	Zeiss	LSM 800, Axio Observer.Z1 /7	Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled airstream incubator
Confocal microscope, Leica	Leica	SP5	Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cells			RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67