Imaging FITC-dextran som Reporter for regulerede exocytose

Summary

Her detalje vi en metode for levende celle billeddannelse af regulerede exocytose. Denne metode udnytter FITC-dextran, der ophobes i lysosomet-relaterede organeller, som reporter. Denne simple metode giver også mulighed for at skelne mellem forskellige former for regulerede exocytose i celler, der er vanskelige at manipulere genetisk.

Abstract

Regulerede exocytose er en proces som last, som er gemt i sekretorisk granulat (SGs), er udgivet som reaktion på en sekretoriske udløser. Regulerede exocytose er grundlæggende for intercellulær kommunikation og er en vigtig mekanisme for udskillelsen af neurotransmittere, hormoner, inflammatoriske mediatorer og andre forbindelser, af en række celler. Mindst tre forskellige mekanismer er kendt for regulerede exocytose: fuld exocytose, hvor en enkelt SG fuldt sikringer med plasma membran, kys og Kør exocytose, hvor en enkelt SG forbigående sikringer med plasma membranen, og sammensatte exocytose, hvor flere SGs fuse med hinanden, før eller efter SG fusion med plasmamembran. Typen af regulerede exocytose foretaget af en celle er ofte dikteret af sekretoriske udløser type. Men i mange celler, en enkelt sekretoriske udløser kan aktivere flere former for lovreguleret exocytose samtidigt. Trods deres overflod og deres betydning på tværs af celletyper og arter er de mekanismer, der bestemmer de forskellige transportformer sekretion i vid udstrækning uløste. En af de vigtigste udfordringer i at undersøge de forskellige transportformer regulerede exocytose, er er vanskeligheden at skelne mellem dem samt udforskning af dem separat. Her beskriver vi brugen af fluorescein isothiocyanat (FITC)-dextran som exocytose reporter og levende celle imaging for at differentiere mellem de forskellige veje af regulerede exocytose, med fokus på sammensatte exocytose, baseret på robustheden og varigheden af exocytic begivenheder.

Introduction

Regulerede exocytose er den primære mekanisme, som let lavet last er frigivet fra en sekretoriske celle som svar på en bestemt udløser. Lasten er pre dannet og afsondret i sekretoriske vesikler, hvor det opbevares indtil en udløser relæer signal til frigivelse af SGs’ indhold. Forskellige typer af signaler kan resultere i forskellige tilstande af regulerede exocytose, eller forskellige former for regulerede exocytose kan forekomme samtidig. Tre vigtigste transportformer regulerede exocytose er kendt: fuld exocytose, der indebærer fuld fusion af en enkelt sekretorisk granulat med plasma membran; kys og Kør exocytose, der indebærer forbigående fusion af granulet sekretoriske med plasma membran efterfulgt af sin genanvendelse; og sammensatte exocytose, som er karakteriseret ved Homotypiske fusion af flere SGs forudgående (dvs, multigranular exocytose) eller sekventiel (dvs., sekventiel exocytose) til fusion med plasma membran¹. Sammensatte exocytose anses for den mest omfattende tilstand af lasten release², da det giver mulighed for hurtig udskillelsen af lasten, herunder fra SGs, der er placeret distale fra plasmamembran. Sammensatte exocytose er blevet dokumenteret i både eksokrine og endokrine celler^{3,4,5,6,7,8,9}, samt i immunceller. I immunceller, såsom eosinofile^10,11,12 og neutrofile¹³, sammensatte exocytose giver mulighed for en hurtig og robust frigivelse af mæglere, der er forpligtet til at dræbe invaderende patogener som bakterier eller parasitter. Mast celler (MCs) installere sammensatte exocytose for effektiv frigivelse af allerede gemte inflammatoriske mediatorer under medfødte immunrespons, anafylaksi og andre allergiske reaktioner^{14,15,16 , 17}. da de forskellige transportformer exocytose kan forekomme samtidigt^18,19, det er blevet en udfordring at skelne mellem dem i realtid eller til at identificere deres respektive fusion machineries, dermed belyse deres underliggende mekanismer.

Her præsenterer vi en metode, baseret på levende celle billeddannelse af celle indlæst FITC-dextran, der giver mulighed for tidstro sporing af exocytic arrangementer og skelne mellem deres forskellige tilstande. Især vores metode giver mulighed for eksklusive overvågning af sammensatte exocytose.

FITC-dextran er en konjugation af pH-følsom fluorophore FITC med glucan polysaccharid dextran. Fluorescently mærket dextrans har vist sig at komme ind i cellen af micropinocytosis^20,21 og macropinocytosis^22,23. Som endocytic rum modnes til lysosomer, har det vist sig at FITC-dextran ophobes i lysosomet med ingen tilsyneladende forringelse. Men da FITC er en meget pH-følsom fluorophore²⁴, og lysosomet lumen er sure, FITC-dextran fluorescens slukker ved ankomsten til lysosomet²⁴. Således etablere dextrans som lysosomet målrettet cargo, sammen med pH følsomheden af FITC, har lagt grundlaget for anvendelse af FITC-dextran i undersøgelser af lysosomet exocytose^{25,26,27 , 28 , 29}.

I flere celletyper, herunder MCs, neutrofile, eosinofile, cytotoksiske T-celler, melanosomer, og andre, SGs vise lysosomale funktioner og er kategoriseret som lysosomet-relaterede organeller (LROs) eller sekretoriske lysosomer^30,31 . Da LROs har en syrlig luminale pH, kan FITC-dextran bruges til at visualisere deres exocytose, som følge af højere pH forbundet med eksteriorisering af LROs. Faktisk er FITC-dextran blevet brugt til at overvåge exocytose i MCs^18,32,33. I denne metode, FITC-dextran føjes til cellekultur, taget af celler af pinocytosis og sorteret i SGs. Som det er i lysosomer, bratkølet FITC fluorescens i SGs, når de er inden for cellen. Dog ved SG fusion med plasma membran og deraf følgende eksponering til det eksterne miljø genvinder FITC-dextran sin fluorescens da SG pH stiger, giver mulighed for enkel sporingen af exocytic arrangementer af levende celle mikroskopi. Her, justeret vi denne metode for at aktivere unikke tracking af sammensatte exocytose.

To andre metoder har været anvendt tidligere til at spore sammensatte exocytose. Elektronmikroskopi var den første metode til at karakterisere exocytic strukturer, der foreslog, at forekomsten af forskellige transportformer exocytose. Navnlig gav bemærkningerne “sekretoriske tunneller” i pancreas acinar celler³⁴ og MCs^35,36,37 anledning til hypotesen om sammensatte exocytose. Men mens den høj opløsning af elektronmikroskopi har beføjelse til at afsløre sammenvoksede vesikler, det kan ikke spore dynamikken i deres fusion og dermed ikke kan definere, om de svarer til SG fusion under sammensatte exocytose eller fusion af genfangede granulat efter deres endocytose. Denne hindring er overvundet i andre metoder, der kan måle exocytose i levende celler, såsom patch klemme målinger af plasma membran kapacitans^11,13,38,39 eller amperometry ⁴⁰ af medierne. Dog patch fastspænding kræver et specielt set-up og kan ikke være egnet til alle celletyper. Amperometry målinger er i stand til at spore exocytose kun hvis lasten er udgivet i meget tæt nærhed af elektroden. Derfor, ved hjælp af levende celle imaging giver en fordel i forhold til disse metoder, så det ikke kun giver mulighed for tidstro sporing af exocytose, men det giver også mulighed for hurtig og enkel erhvervelse af data fra hele cellen.

Sporing af FITC-dextran af levende celle mikroskopi tilbyder også nogle fordele ved at andre levende celle imaging-baserede metoder. For eksempel, er en meget udbredt metode total interne reflection Fluorescens mikroskopi (TIRFM) af celler fyldt med en fluorescerende SG sonde eller udtrykker en fluorescerende proteiner-tagged SG last eller membran protein^{26,41, 42 , 43}. denne metode styrke ligger i dens evne til at overvåge udelukkende hændelser, som forekommer tæt på plasma membran (herefter kaldet fodaftryk), derfor exocytic begivenheder. Dette er dog også Ulempen ved denne metode fordi kun den celle fraktion, der støder op til daekglas og tæt på mikroskop linse kan være afbildet⁴⁴. Om sådanne fodspor faktisk repræsenterer hele cellemembranen overflade er stadig tvivlsomt^45,46,47. I denne forbindelse tillader ved hjælp af et pH-følsom farvestof som FITC-dextran og en standard fluorescens mikroskop eller en Konfokal mikroskop med en åben hul billeddannelse af hele cellen, således indfange de samlede exocytic hændelser, der indtræffer i cellen.

Yderligere pH-følsom journalister, der bruges til at studere regulerede exocytose af hele cellen imaging eller TIRFM omfatter SG last eller SG membran protein sammenvokset til phlourin, en pH-følsom normal god landbrugspraksis variant. Eksempler kan nævnes NPY – phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin, og synapto-phluorin^{48,49,50,51,52}. Mens udtryk for disse sonder kan repræsentere tættere endogene sammensætningen af SGs, det indebærer Transfektion af cellerne, og kan derfor være mindre egnet til celler, der er vanskelige at transfect. Derfor, hvornår studerer celler der er vanskeligt at transfect eller under eksperimentelle betingelser, der kræver flere genomisk manipulationer, brug af et stof, der blot kan suppleres i cellekulturmedium, såsom FITC-dextran, er fordelagtigt . FITC-dextran tilbyder også en fordel over acridin orange (AO), en anden pH-følsom farvestof, der er blevet brugt til at spore exocytose levende celle mikroskopi^53,54,55,,^{56 , 57 , 58}. AO har vist sig at fremkalde fotolyse af vesikler, resultere i falske blinker, som ikke svarer til faktiske sekretion processer²⁷. Derimod afspejler FITC-dextran bedre sekretion begivenheder, formentlig på grund af sin lave foto-induceret produktion af reaktive oxygen²⁷.

Især er en alternativ tilgang til at studere exocytose ved at spore tilstrømningen af et farvestof, fra den eksterne medium i SG gennem fusion pore, der åbner i løbet af denne proces. I dette tilfælde er farvestoffet føjet til den eksterne medium sammen med den sekretoriske udløser. Derefter, når fusion pore åbner, farvestoffet trænger ind SG^59,60. En klar fordel ved denne metode er, at det også giver mulighed for at estimere porestørrelse fusion ved hjælp af farvestoffer af variabel størrelse. For eksempel, kan dextrans af forskellige molekylvægt (MW), konjugeret med forskellige fluorophores, bruges som ekstracellulære farvestoffer, hvorved den maksimale størrelse af dextran, der kan trænge SG ville svare til størrelsen af fusion pore^{59, 61 , 62 , 63 , 64}. Derudover denne metode kræver ikke brug af et pH-følsom sonde. En væsentlig ulempe er imidlertid, at signalet / støjforhold er meget lav, da en stor mængde farvestof er til stede i medierne i løbet af erhvervelse af billeder, hvilket resulterer i høje baggrund.

Samlet set overvinder anvendelse af FITC-dextran som markør for exocytose flere ulemper i tidligere rapporterede metoder, såsom signal-støj-forholdet, toksicitet, dynamisk sporing og kompleksitet.

Her beskriver vi anvendelse af FITC-dextran at overvåge sammensatte exocytose i linjen RBL – 2H 3 mast celle (herefter omtalt som RBL, primært etableret af Eccleston et al. ⁶⁵ og yderligere klonet af Barsumian et al. ⁶⁶), som svar på immunglobulin E (IgE) / antigen (Ag) aktivering.

Protocol

1. præparater Forberedelse af RBL kultur medier Mix 500 mL af lav glucose Dulbecco ændrede Eagle’s medium (DMEM) med 56 mL føtalt bovint serum (FBS), 5,5 mL af penicillin-streptomycin-nystatin løsning, 5,5 mL L-glutamin 200 mM løsning. Dette resulterer i lav glucose DMEM suppleret med 10% FBS, 100 µg/mL streptomycin, 100 enheder/mL penicillin, 12 enheder/mL nystatin og 2 mM L-glutamin. Filtrere medierne ved hjælp af en top-vakuum filter med 0,22 µm porestørrelse og butik ved 4 ° C.<…

Representative Results

Figur 1a repræsenterer skematisk hvordan FITC-dextran kan fungere som en reporter for reguleret exocytose og sammenfatte de forskellige former for exocytic begivenheder. Først, cellerne inkuberes med FITC-dextran, som er internaliseret af pinocytosis og sorteret til SGs. Da SGs MCs er LROs, deres lav pH dæmper fluorescens af FITC, vises her som sort granulat (A-C, jeg). Når celler er udløst af en secretagogue og SGs fuse med plasma membran, dannes en fus…

Discussion

Her beskriver vi, hvordan opsporing fluorescens af FITC-dextran indlæst ind SGs kan bruges til at specifikt fange sammensatte exocytose begivenheder. Dette blev opnået ved at indstille mikroskop til at erhverve et billede hvert 15 sekund, hvilket sikrer at kun langvarige begivenheder vil blive registreret over tid og derfor undtagen kort begivenheder, der ville svare til fuld exocytose eller kys og Kør exocytose. For at fastlægge metoden, viste vi at knockdown af Rab5 isoformer, der udtrykkes i RBL celler, og er afg?…

Materials

DMEM low glucose	Biological Inductries	01-050-1A
Fetal bovine serum	Gibco	12657
Pen-strep-nystatin solution	Biological Inductries	03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution	Biological Inductries	03-020-1A
FITC dextran 150K	Sigma-Aldrich	46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution B	Biological Inductries	03-052-1A	Warm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size	Sigma-Aldrich	CLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore size	Sartorius	16534K
Chambered coverglass	Thermo scientific	155411
Corning tissue-culture treated culture dishes	Sigma-Aldrich	CLS430167
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503
Anti-DNP monoclonal IgE	Sigma-Aldrich	D8406
DNP-HSA (Ag)	Sigma-Aldrich	A6661	Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4	Biological Inductries	03-025-1B
CaCl2	MERK	102382
Glucose	BDH Laboratories	284515V
Ammonium chloride	MERK	1145
PIPES dipotassium salt	Sigma-Aldrich	108321-27-3
Calcium acetate hydrate	Sigma-Aldrich	114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate)	Sigma-Aldrich	G1501
NaH2PO4	MERK	6346
NaCl	MERK	106404
MgCl2	MERK	105833
KCl	MERK	104936
Electroporator	BTX	ECM830
Confocal microscope, Zeiss	Zeiss	LSM 5 Pascal, Axiovert 200M	Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled airstream incubator
Confocal microscope, Zeiss	Zeiss	LSM 800, Axio Observer.Z1 /7	Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled airstream incubator
Confocal microscope, Leica	Leica	SP5	Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cells			RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67