L’imagerie FITC-dextran comme Reporter pour l’exocytose régulée

Summary

Ici nous détailler une méthode d’imagerie de cellules vivantes d’exocytose régulée. Cette méthode utilise la FITC-dextran, qui s’accumule dans les organites liés lysosome, comme journaliste. Cette méthode simple permet également de faire la distinction entre les différents modes d’exocytose régulée dans les cellules qui sont difficiles à manipuler génétiquement.

Abstract

Exocytose régulée est un processus par lequel cargo, qui est stocké dans des granules sécrétoires (SGs), est libéré en réponse à un déclencheur sécrétoire. Exocytose régulée est fondamentale pour la communication intercellulaire et est un mécanisme essentiel pour la sécrétion de neurotransmetteurs, hormones, médiateurs de l’inflammation et d’autres composés, par une variété de cellules. Au moins trois mécanismes distincts sont connus pour l’exocytose régulée : exocytose complet, où un seul SG entièrement fusionne avec la membrane plasmique, exocytose kiss-and-run, où un seul SG transitoirement fusionne avec la membrane plasmique, et composé exocytose, où plusieurs GV se fusible entre eux, avant ou après la fusion de SG avec la membrane plasmique. Le type d’exocytose régulée par une cellule est souvent dicté par le type de déclencheur sécrétoire. Toutefois, dans de nombreuses cellules, un seul déclencheur sécrétoire peut activer plusieurs modes d’exocytose régulée en même temps. Malgré leur abondance et leur importance à travers les espèces et les types de cellules, les mécanismes qui déterminent les différents modes de sécrétion sont en grande partie irrésolues. Un des défis principaux dans les enquêtes sur les différents modes d’exocytose régulée, est la difficulté de distinguer entre eux ainsi que d’explorer leur séparément. Nous décrivons ici l’utilisation de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-dextran comme un reporter de l’exocytose et direct imagerie cellulaire, afin de différencier les différentes voies d’exocytose régulée, en se concentrant sur l’exocytose composé, basé sur la robustesse et durée des événements exocytiques.

Introduction

Exocytose régulée est le principal mécanisme par lequel facilement fait fret est libéré d’une cellule sécrétrice en réponse à un déclencheur spécifique. La cargaison est préformée et séquestrée dans des vésicules sécrétoires, dans lequel elle est stockée jusqu’à ce qu’un déclencheur relaie le signal pour la libération du contenu les cas suivants. Différents types de signaux peuvent entraîner dans des modes différents d’exocytose régulée ou modes d’exocytose régulée peuvent se produire simultanément. Trois modes principaux d’exocytose réglementé sont connus : exocytose complet, ce qui implique une fusion complète d’un seul granule sécrétoire avec la membrane plasmique ; Kiss-and-run exocytose, qui implique la fusion transitoire du granule sécrétion avec la membrane plasmique, suivie de ses activités de recyclage ; et exocytose composé, qui se caractérise par la fusion homotypique de plusieurs GV avant (c’est-à-dire, multigranulaire exocytose) ou séquentielle (c.-à-d., exocytose séquentielle) à la fusion avec la membrane plasmique¹. Exocytose composé est considéré comme le plus vaste mode de fret release², car elle permet la sécrétion rapide du fret, y compris celle de SGs qui situent trouvent distale de la membrane plasmique. Exocytose composé a été documenté dans les deux cellules exocrines et endocrines^{3,4,5,6,7,8,9}, ainsi que dans cellules immunitaires. Dans les cellules immunitaires, telles que les éosinophiles^10,11,12 et neutrophiles¹³, composé exocytose permet la libération rapide et robuste de médiateurs qui sont nécessaires pour tuer les pathogènes envahisseurs tels que bactéries ou parasites. Mastocytes (MCs) déployer l’exocytose composé la libération efficace de médiateurs inflammatoires pré-enregistrée au cours des réactions immunitaires innées, anaphylaxie et autres réactions allergiques^{14,15,16 , 17}. étant donné que les différents modes d’exocytose peuvent se produire simultanément à^18,19, il est devenu un défi pour distinguer entre eux en temps réel ou pour identifier leurs mécanismes de fusion respectifs, donc élucider leurs mécanismes sous-jacents.

Nous présentons ici une méthode basée sur des cellules vivantes imagerie de cellules chargées de FITC-dextran, qui permet le suivi en temps réel des événements de sécrétion et faire la distinction entre leurs différents modes. En particulier, notre méthode permet la surveillance exclusive d’exocytose composé.

FITC-dextran est un conjugé du fluorophore sensibles au pH FITC avec le dextran de polysaccharide glucan. Dextranes fluorescent étiquetés ont démontré d’entrer dans la cellule de micropinocytose^20,21 et macropinocytose^22,23. Compartiments endocytose à maturité dans les lysosomes, il a été démontré que la FITC-dextran s’accumule dans les lysosomes avec aucune dégradation apparente. Cependant, puisque FITC est un fluorophore hautement sensibles au pH²⁴, et la lumière du lysosome est acide, fluorescence FITC-dextran étanche en arrivant le lysosome²⁴. Ainsi, établissant des dextranes dans le lysosome ciblées de cargaison, conjugué à la sensibilité de pH du FITC, ont jeté les bases pour l’utilisation du FITC-dextran dans les études du lysosome exocytose^{25,26,27 , 28 , 29}.

Dans plusieurs types de cellules, y compris les MCs, neutrophiles, les éosinophiles, les cellules T cytotoxiques, mélanosomes et autres, la SGs lysosomales caractéristiques d’affichage et sont qualifiée d’organites liés lysosome (BEI) ou sécrétoire lysosomes^30,31 . Étant donné que la BEI ont un pH acide luminal, FITC-dextran peut servir à visualiser leur exocytose, suite à des pH plus élevés lié à l’extériorisation de la BEI. En effet, FITC-dextran a été utilisé pour surveiller l’exocytose dans MCs^18,32,33. Dans cette méthode, FITC-dextran est ajoutée à la culture cellulaire, capté par les cellules par pinocytose et trié dans la SGs. Comme il est dans les lysosomes, fluorescence FITC est trempé dans la SGs quand ils sont dans la cellule. Toutefois, à la fusion de SG avec la membrane plasmique et l’exposition qui en résulte dans le milieu externe, le FITC-dextran regagne sa fluorescence SG pH montante, permettant le suivi simple des événements de sécrétion par microscopie des cellules vivantes. Ici, nous avons ajusté cette méthode pour activer le suivi unique d’exocytose composé.

Deux autres méthodes ont servi auparavant pour suivre l’exocytose composé. La microscopie électronique a été la première méthode pour caractériser les structures de sécrétion qui suggèrent la présence de différents modes d’exocytose. En particulier, observations de « tunnels sécrétoires » dans les cellules acineuses du pancréas³⁴ et MCs^35,36,37 a donné lieu à l’hypothèse d’exocytose composé. Cependant, alors que la haute résolution de la microscopie électronique a le pouvoir de révéler les vésicules fusionnées, il ne peut pas suivre la dynamique de leur fusion et par conséquent impossible de définir si elles correspondent à la fusion de SG au cours de l’exocytose composé ou fusion de granules récupérés suite à leur endocytose. Cet obstacle est surmonté dans d’autres méthodes permettant de mesurer l’exocytose dans les cellules vivantes, telles que les mesures de pince de patch de la membrane plasmique capacité^11,13,,du³⁸³⁹ ou ampérométrie ⁴⁰ des médias. Cependant, serrage patch requiert une configuration particulière et peut ne pas convenir pour tous les types de cellules. Ampérométrie mensurations sont en mesure de suivre l’exocytose uniquement si la cargaison est libérée à proximité de l’électrode. Par conséquent, à l’aide de l’imagerie de cellules vivantes vous propose un avantage par rapport à ces méthodes, car il permet non seulement de suivi en temps réel d’exocytose, mais il permet également l’acquisition rapide et simple des données de la cellule entière.

Le suivi du FITC-dextran par microscopie des cellules vivantes offre également certains avantages aux autres cellules vivantes méthodes basées sur l’imagerie. Par exemple, une méthode largement utilisée est la microscopie de fluorescence de réflexion totale interne (TIRFM) des cellules chargées avec une sonde fluorescente de SG ou exprimant un fluorescent protéine-tag SG fret ou membrane protéines^{26,41, 42 , 43}. la force de cette méthode réside dans sa capacité à surveiller uniquement les événements qui se produisent à proximité de la membrane plasmique (ci-après dénommée “empreinte”), d’où des événements de sécrétion. Cependant, c’est aussi l’inconvénient de cette méthode, car seule la fraction cellulaire qui est à côté de la lamelle et à proximité de la lentille du microscope peut être imagé⁴⁴. Si ces empreintes représentent en effet la surface de la membrane de la cellule entière est encore discutable^45,46,47. À cet égard, à l’aide d’un colorant sensibles au pH comme FITC-dextran et un microscope à fluorescence standard ou un microscope confocal avec un sténopé ouvert permet l’imagerie de la cellule entière, capturant ainsi les sécrétion total événements qui se produisent dans cette cellule.

Les journalistes sensibles au pH supplémentaires qui sont utilisés pour étudier l’exocytose régulée par imagerie de cellules entières ou TIRFM incluent fret SG ou protéine de membrane de SG Fondue à phlourin, une variante GFP sensibles au pH. Citons NPY – phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin et synapto-phluorin^{48,49,50,51,52}. Alors que l’expression de ces sondes peut-être représenter de plus près la composition endogène de la SGs, il implique la transfection des cellules et donc peut être moins approprié pour les cellules qui sont difficiles à transfecter. Par conséquent, quand étudiant les cellules qui sont difficiles à transfecter ou dans des conditions expérimentales qui nécessitent plusieurs manipulations génomiques, l’utilisation d’un composé qui peut être simplement complété dans le milieu de culture cellulaire, comme FITC-dextran, est avantageuse . FITC-dextran offre également un avantage par rapport à l’acridine orange (AO), un autre colorant pH sensible qui a été utilisé pour le suivi de l’exocytose de cellules vivantes microscopie^53,,du^{5455,56 , 57 , 58}. AO a été montré pour induire la photolyse des vésicules que résultat en fausses flashs, qui ne correspondent pas à la sécrétion réelle des processus²⁷. En revanche, FITC-dextran reflète mieux événements de sécrétion, probablement en raison de sa faible production photoinduit oxygénées²⁷.

Une autre approche pour l’étude de l’exocytose est notamment par l’afflux d’un colorant, du milieu externe dans le SG par le pore de fusion qui s’ouvre au cours de ce processus de suivi. Dans ce cas, le colorant est ajouté au milieu externe aux côtés de la gâchette sécrétoire. Puis, lorsque le pore de fusion s’ouvre, le colorant diffuse dans le SG^59,60. Un net avantage de cette méthode est qu’elle offre également la possibilité d’estimer la taille de pore de fusion, par l’utilisation de colorants, de taille variable. Par exemple, dextrans de différents poids moléculaires (MW), conjugué à des fluorophores différents, peuvent être utilisés comme colorants extracellulaires selon laquelle la taille maximale du dextran qui peut pénétrer la SG correspond à la taille des pores fusion^{59, 61 , 62 , 63 , 64}. en outre, cette approche ne nécessite pas l’utilisation d’une sonde de pH-sensibles. Cependant, un inconvénient majeur est que le rapport signal sur bruit est très faible, puisqu’une grande quantité de colorant est présente dans les médias lors de l’acquisition d’images, ayant pour résultat de fond élevé.

Dans l’ensemble, l’utilisation du FITC-dextran comme marqueur pour l’exocytose surmonte plusieurs inconvénients des méthodes rapportées antérieurement, comme signal/bruit ratio, toxicité, suivi dynamique et complexité.

Nous décrivons ici l’utilisation de FITC-dextran pour surveiller l’exocytose composé dans la ligne de 3 cellules de mât RBL – 2H (ci-après dénommée RBL, principalement établie par Eccleston et al. ⁶⁵ et encore cloné par Barsumian et al. ( ⁶⁶), en réponse à immunoglobuline E (IgE) / activation de l’antigène (Ag).

Protocol

1. les préparatifs Préparation des milieux de culture RBL Mélanger 500 mL de glucose bas Dulbecco aigle modifié (DMEM) avec 56 mL de sérum fœtal (SVF), 5,5 mL de solution de pénicilline-streptomycine-nystatine, 5,5 mL de solution de L-Glutamine 200 mM. Il en résulte une glycémie basse DMEM additionné de 10 % FBS, 100 µg/mL de streptomycine, 100 unités/mL de pénicilline, la nystatine 12 unités/mL et 2 mM de L-glutamine. Filtrer les médias en utilisant un filtre de haut-vide de 0…

Representative Results

Figure 1 a représente schématiquement comment FITC-dextran peut agir comme reporter pour régies exocytose et récapituler les différents modes d’événements exocytiques. Tout d’abord, les cellules sont incubées avec FITC-dextran, qui est internalisé par pinocytose et triée à la GV. Étant donné que le SGs de MCs sont LROs, leur faible pH amortit la fluorescence du FITC, présenté ici en noir granules (A-C, I). Lorsque les cellules sont déclenc…

Discussion

Ici, nous décrivons comment traçage la fluorescence du FITC-dextran chargé dans SGs peut être utilisée pour capturer spécifiquement les événements de l’exocytose composé. Ceci a été réalisé en affectant le microscope en vue d’acquérir une image toutes les 15 secondes, ce qui assure que seuls les événements de longue durée seront enregistrées au fil du temps et donc à l’exclusion de quelques événements qui correspondraient à l’exocytose complet ou l’exocytose kiss-and-run. Pour établir la …

Materials

DMEM low glucose	Biological Inductries	01-050-1A
Fetal bovine serum	Gibco	12657
Pen-strep-nystatin solution	Biological Inductries	03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution	Biological Inductries	03-020-1A
FITC dextran 150K	Sigma-Aldrich	46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution B	Biological Inductries	03-052-1A	Warm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size	Sigma-Aldrich	CLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore size	Sartorius	16534K
Chambered coverglass	Thermo scientific	155411
Corning tissue-culture treated culture dishes	Sigma-Aldrich	CLS430167
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503
Anti-DNP monoclonal IgE	Sigma-Aldrich	D8406
DNP-HSA (Ag)	Sigma-Aldrich	A6661	Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4	Biological Inductries	03-025-1B
CaCl2	MERK	102382
Glucose	BDH Laboratories	284515V
Ammonium chloride	MERK	1145
PIPES dipotassium salt	Sigma-Aldrich	108321-27-3
Calcium acetate hydrate	Sigma-Aldrich	114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate)	Sigma-Aldrich	G1501
NaH2PO4	MERK	6346
NaCl	MERK	106404
MgCl2	MERK	105833
KCl	MERK	104936
Electroporator	BTX	ECM830
Confocal microscope, Zeiss	Zeiss	LSM 5 Pascal, Axiovert 200M	Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled airstream incubator
Confocal microscope, Zeiss	Zeiss	LSM 800, Axio Observer.Z1 /7	Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled airstream incubator
Confocal microscope, Leica	Leica	SP5	Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cells			RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67