이미징 FITC-dextran 규제 Exocytosis 위한 기자로 서

Summary

여기 우리는 규제 exocytosis의 라이브 셀 이미징 방법 선발. 이 메서드는 기자로 서 FITC-dextran, 리소좀과 관련 된 세포에 축적을 활용 합니다. 이 간단한 메서드는 또한 유전자 조작 하기 어려운 셀에 규제 exocytosis의 다른 모드 사이 구별 수 있습니다.

Abstract

규제 exocytosis는 화물 분 비과 립 (SGs)에 저장 되어 있는 분 비 방 아 쇠에 대 한 응답에 출시 하는 과정 이다. 규제 exocytosis 세포 커뮤니케이션에 대 한 기본 이며 신경 전달 물질, 호르몬, 염증 중재자 및 세포의 다양 한 다른 화합물의 분 비에 대 한 핵심 메커니즘입니다. 적어도 세 가지 메커니즘 규제 exocytosis 알려져 있다: 전체 exocytosis, 단일 SG 키스 실행 exocytosis, 어디 하나의 SG는 뚜렷이 플라즈마 막으로 퓨즈, 그리고 복합 exocytosis, 플라즈마 막으로 완전히 퓨즈 어디 이전에 또는 플라즈마 막으로 SG 퓨전 후 여러 SGs 서로 융합. 셀에 의해 착수 하는 규제 exocytosis 유형의 자주 분 비 트리거 유형에 의해 결정 됩니다. 그러나, 많은 셀에 단일 분 비 트리거를 활성화할 수 있다 규제 exocytosis의 다중 모드 동시에. 그들의 풍요로 움과 세포 유형 및 종 중요성에도 불구 하 고 분 비의 다른 모드를 결정 하는 메커니즘 크게 확인 되지 않습니다. 규제 exocytosis의 다른 모드를 조사 하 고 있는 주요 과제 중 하나입니다 뿐만 아니라 그들을 별도로 탐험으로 그들 사이 구별에 어려움. 여기 우리가 fluorescein isothiocyanate (FITC)를 사용 하 여 설명-dextran exocytosis 기자 및 라이브 셀 이미징, 규제 exocytosis, 복합 exocytosis에 초점의 다른 경로 구분 하는 견고성에 따라 고 exocytic 이벤트의 기간입니다.

Introduction

규제 exocytosis를 쉽게 만든된 화물 특정 트리거에 분 비 세포에서 출시 하는 기본 메커니즘입니다. 화물은 미리 형성 하 고 그것까지 트리거 릴레이 SGs의 콘텐츠의 출시에 대 한 신호 저장 되어 있는 분 비 소포에 압수. 다양 한 유형의 신호 규제 exocytosis의 다른 모드에서 발생할 수 있습니다 또는 다른 형태의 규제 exocytosis 동시에 발생할 수 있습니다. 규제 exocytosis의 세 가지 주요 모드 알려져 있습니다: 전체 exocytosis, 원형질 막;와 단일 분 비과 립의 완전 융합을 포함 키스 실행 exocytosis, 재활용; 다음 플라즈마 막으로 분 비과 립의 과도 융합을 포함 그리고 여러 SGs 이전 (즉, multigranular exocytosis)의 homotypic 융합이 특징인 복합 exocytosis 순차적 또는 (즉, 순차 exocytosis) 플라즈마 멤브레인¹퓨전 하. 복합 exocytosis 간주 됩니다 화물 릴리스²의 가장 광범위 한 모드는 SGs에서를 포함 하 여 화물의 빠른 분 비에 대 한 수 플라즈마 멤브레인에서 원심. 모두 외 분 비 및 내 분 비 세포^{3,,45,6,7,8,9}에서 복합 exocytosis 문서화 되었습니다. 면역 세포입니다. 면역 세포, 호 산 구는^10,,1112 및 호 중구¹³, 같은 복합 exocytosis 수 같은 침입 병원 체를 죽 일 하는 데 필요한 중재자의 신속 하 고 강력한 출시 박테리아 또는 기생충입니다. 타고 난 면역 반응, 알레르기, 및 다른 알레르기 반응^14,,1516 미리 저장 된 염증 성 중재자의 효율적인 릴리스에 대 한 복합 exocytosis를 배포 하는 돛대 세포 (MCs) ^{, 17}. exocytosis의 다양 한 모드로^18,19를 동시에 발생할 수 있습니다, 이후 그것은 실시간으로 그들을 구별 하거나 그들의 각각 융합 기계, 따라서 elucidating 식별 도전 되고있다 그들의 기본 메커니즘입니다.

여기에 우리가 메서드를 기반으로 현재 라이브 셀에 셀의 이미지 로드 FITC-dextran, exocytic 이벤트의 실시간 추적 및 그들의 다른 모드를 구별 하는. 특히, 우리의 메서드 복합 exocytosis의 독점 모니터링 수 있습니다.

FITC dextran 글 루 칸 다 당 류 dextran와 pH에 민감한 fluorophore FITC 켤레입니다. 붙일 레이블된 dextrans micropinocytosis^20,21 , macropinocytosis^,2223여 셀 입력 표시 되었습니다. Endocytic 구획 리소좀으로 성숙, 그것은 보였다 FITC dextran 명백한 저하 없이 리소좀 축적. 그러나, FITC는 높은 pH에 민감한 fluorophore²⁴리소좀 루멘은 산 성 때문에, FITC dextran 형광 리소좀²⁴를 도달 하는 즉시 냉각. 따라서, 화물, FITC의 pH 감도 함께 찍은 대상 리소좀으로 dextrans를 설립, 리소좀 exocytosis^25,,2627 의 연구에 FITC dextran의 사용을 위한 기초 마련 ^{, 28 , 29}.

MCs, 호 중구, 호 산 구는, 세포 독성 T 세포, melanosomes, 및 다른 사람을 포함 한 여러 세포 유형, SGs lysosomal 기능을 표시 하 고 리소좀 관련 세포 (LROs) 또는 분 비 리소좀^{30,31로 분류 됩니다.} . LROs 산 성 luminal pH 때문에, FITC dextran 높은 pH는 LROs의 exteriorization와 관련 된 결과로 그들의 exocytosis 시각화를 사용할 수 있습니다. 실제로, FITC dextran MCs^18,,3233exocytosis를 모니터링 하는 데 사용 되었습니다. 이 방법에서는, FITC dextran 세포 배양에 추가, pinocytosis 하 여 셀에 의해 촬영 이며 SGs에 정렬. 그것은 리소좀 때 그들이 셀 내에 SGs에 FITC 형광 침묵 이다. 그러나, 플라즈마 멤브레인 및 외부 환경에 따른 노출 SG 퓨전, 따라 FITC dextran 차릴 SG pH 상승으로 그것의 형광 라이브 셀 현미경 검사 법에 의해 exocytic 이벤트의 간단한 추적 허용. 여기, 우리는 복합 exocytosis의 고유 추적을 사용 하도록이 메서드를 조정.

다른 두 가지 방법은 이전 복합 exocytosis를 추적 하기 위해 사용 되었습니다. 전자 현미경은 exocytosis의 다른 모드의 발생을 제안 하는 exocytic 구조를 특성화 하기 위해 첫 번째 방법입니다. 특히, “분 비 터널” 췌 장 acinar 셀³⁴ 에 MCs^35,,3637 의 복합 exocytosis의 가설에 상승을 했다. 그러나, 전자 현미경 검사 법의 높은 해상도 융합된 소포를 공개 하는 힘, 그것은 그들의 융해의 역학을 추적할 수 없습니다. 및 따라서 복합 exocytosis 동안 SG 퓨전 또는 다시 캡처한 알갱이의 융합에 대응 여부를 정의할 수 없습니다. 다음 그들의 endocytosis. 살아있는 세포, 원형질 막 커패시턴스^11,13,,3839 또는 amperometry의 패치 클램프 측정 등에서 exocytosis를 측정할 수 있는 다른 방법에이 장애물을 극복 미디어의 ⁴⁰ . 그러나, 패치 죄는 특별 한 설정 필요 하며 모든 세포 유형에 적합 하지 않을 수 있습니다. Amperometry 측정 exocytosis 화물 전극에 매우 가까이에 출시 하는 경우에 추적할 수 있습니다. 따라서, 그것은 뿐만 아니라 허용 exocytosis의 실시간 추적 하지만 그것 또한 모든 셀에서 데이터의 신속 하 고 간단한 수집 수 있습니다 이러한 방법을 통해 이점을 제공 라이브 셀 이미징 사용 하 여 합니다.

라이브 셀 현미경 검사 법에 의해 FITC dextran의 추적 또한 몇 가지 장점을 다른 라이브 셀 이미징 기반 방법을 제공합니다. 예를 들어 널리 사용 되는 방법은 세포 형광 SG 프로브 로드 또는 표현 하는 형광 단백질 태그 SG 화물 또는 막 단백질^26,41, 의 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)는 ^{42 , 43}.이 방법의 강점 독점적으로 (여기 라고도 발자국), 원형질 막 가까이 발생 하는 이벤트를 모니터링 하는 기능에 따라서 exocytic 이벤트. 그러나, 이것은 또한이 방법의 단점은 셀 일부분만 하는 coverglass에 인접 한 현미경 렌즈에 가까운 수⁴⁴군데 있기 때문에. 같은 발자국 실제로 전체 세포 막 표면 표시 하는지 여부를 여전히 미해결^45,,4647이다. 이와 관련, 오픈 pinhole와 FITC dextran 등 pH에 민감한 염료 및 표준 형광 현미경 confocal 현미경을 사용 하 여 따라서 해당 셀에 발생 하는 총 exocytic 이벤트를 캡처, 전체 셀의 이미지를 수 있습니다.

전체 셀 이미징 또는 TIRFM 규제 exocytosis를 공부 하는 데 사용 되는 추가 pH에 민감한 기자 SG 화물 또는 SG 막 단백질 phlourin, pH에 민감한 GFP 변종 융합을 포함 합니다. 예로 NPY-phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin, 및 synapto phluorin^{48,49,50,,5152}있습니다. 이러한 프로브 식 SGs의 내 생 적인 구성을 더 밀접 하 게 나타낼 수, 그것은 세포의 transfection를 수반 고 따라서 덜 어려운 transfect 세포에 적합 있을 수 있습니다. 따라서 때 세포 공부 transfect 어렵다 또는 여러 게놈 조작이 필요로 하는 실험 조건에서 세포 배양의 FITC-dextran 등으로 간단 하 게 보완 될 수 있습니다 화합물의 사용이 유리 . FITC dextran 또한 제공 하는 이점을 acridine 오렌지 (AO), 라이브 셀 현미경^53,54,,5556 여 exocytosis의 추적을 위해 사용 된 또 다른 pH에 민감한 염료 ^{, 57 , 58}. 아오 소포 실제 분 비와 일치 하지 않는 거짓 플래시에서 결과²⁷처리의 photolysis를 유도 하기 위해 표시 되었습니다. 반면, FITC dextran 반응성 산소²⁷의 그것의 낮은 사진 유도 된 생산 때문에 아마 더 나은 분 비 이벤트를 반영합니다.

특히, exocytosis 공부에 대 한 다른 접근 방법이입니다 융합 기 공이 과정을 통해 SG에 외부 매체에서 염료의 유입에 추적. 이 경우에 염료 분 비 트리거 함께 외부 매체에 추가 됩니다. 다음, 융합 기 공이 열리면 염료 SG^59,60으로 확산. 이 방법의 명확한 이점은 이다 그것 또한 가변 크기의 염료의 사용에 의해 융합 기 공 크기를 예측 하는 기능을 제공 합니다. 예를 들어 서로 다른 분자량 (MW), 다른 fluorophores에 활용 된의 dextrans SG를 관통할 수 있다 dextran의 최대 크기 것 융합 공^59, 의 크기에 해당 하는 그것에 의하여 extracellular 염료로 사용할 수 있습니다. ^{61 , 62 , 63 , 64}. 또한,이 방법은 pH에 민감한 프로브를 사용 하 여 필요 하지 않습니다. 그러나, 중요 한 불리가 이다 신호 대 잡음 비는 매우 낮은 이기 때문에 많은 양의 염료는 미디어에 높은 백그라운드에서 발생 하는 이미지의 중.

전반적으로, exocytosis 마커로 FITC dextran 사용 신호 소음 비율, 독성, 동적 추적 및 복잡성 등 이전에 보고 된 방법에 몇 가지 단점을 극복 했다.

여기 우리는 FITC-dextran (여기 라고도 RBL, Eccleston 외 에 의해 주로 설립 RBL-2 H 3 돛대 세포 라인에 복합 exocytosis 모니터의 사용 설명 ⁶⁵ Barsumian 그 외 여러분 에 의해 복제 추가 ⁶⁶)에 면역 글로불린 E (IgE) / 항 원 (Ag) 활성화.

Protocol

1입니다. 준비 RBL 문화 미디어의 준비 낮은 포도 당 Dulbecco의의 믹스 500 mL 페니실린-스-nystatin 솔루션, L-글루타민 200 m m 솔루션의 5.5 mL의 5.5 mL 소 태아 혈 청 (FBS)의 56 mL와이 글의 중간 (DMEM)를 수정합니다. 낮은 포도 당에서이 결과 DMEM와 10 S, 100 µ g/mL 스, 100 단위/mL 페니실린, 12 단위/mL nystatin, 2 mM L-글루타민 보충. 4 ° c.에 0.22 μ m 기 공 크기 및 저장소의 최고 진공 필터를 사?…

Representative Results

그림 1a 는 개요로 exocytosis를 규제 하 고 exocytic 이벤트의 다양 한 모드를 정리 FITC dextran 기자로 서 행동 수 있습니다 얼마나 나타냅니다. 첫째, 세포 FITC-dextran, pinocytosis에 의해 내 면 고 SGs 정렬와 함께 알을 품는. MCs의 SGs LROs 이기 때문에, 그들의 낮은 pH FITC, 그림과 같이 검은 알갱이의 형광을 따 윈 (A-C, 난). 세포는 간접적인 및 플라즈마 막으로 SGs ?…

Discussion

여기 어떻게 추적 FITC-dextran SGs에 로드의 형광 특히 복합 exocytosis 이벤트를 캡처하는 데 사용할 수 있습니다 설명 합니다. 이 인수는 이미지 15 초 마다 현미경을 설정, 따라서 시간이 지남에, 오랫동안 이벤트만 기록 됩니다 하 고 따라서 짧은 것이 해당 하는 이벤트 전체 exocytosis 또는 키스 실행 exocytosis를 제외 하 여 달성 되었다. 메서드를 설정 하려면 우리는 RBL 세포에 표현 되 고 복합 exocytosis 중…

Materials

DMEM low glucose	Biological Inductries	01-050-1A
Fetal bovine serum	Gibco	12657
Pen-strep-nystatin solution	Biological Inductries	03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution	Biological Inductries	03-020-1A
FITC dextran 150K	Sigma-Aldrich	46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution B	Biological Inductries	03-052-1A	Warm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size	Sigma-Aldrich	CLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore size	Sartorius	16534K
Chambered coverglass	Thermo scientific	155411
Corning tissue-culture treated culture dishes	Sigma-Aldrich	CLS430167
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503
Anti-DNP monoclonal IgE	Sigma-Aldrich	D8406
DNP-HSA (Ag)	Sigma-Aldrich	A6661	Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4	Biological Inductries	03-025-1B
CaCl2	MERK	102382
Glucose	BDH Laboratories	284515V
Ammonium chloride	MERK	1145
PIPES dipotassium salt	Sigma-Aldrich	108321-27-3
Calcium acetate hydrate	Sigma-Aldrich	114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate)	Sigma-Aldrich	G1501
NaH2PO4	MERK	6346
NaCl	MERK	106404
MgCl2	MERK	105833
KCl	MERK	104936
Electroporator	BTX	ECM830
Confocal microscope, Zeiss	Zeiss	LSM 5 Pascal, Axiovert 200M	Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled airstream incubator
Confocal microscope, Zeiss	Zeiss	LSM 800, Axio Observer.Z1 /7	Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled airstream incubator
Confocal microscope, Leica	Leica	SP5	Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cells			RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67