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Biologie

Proyección de imagen de FITC-dextrano como reportero para exocitosis regulada

Published: June 20, 2018
doi:
10.3791/57936
, , , , ,
1Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine,Tel Aviv University, 2Department of Pathology, Sackler Faculty of Medicine,Tel Aviv University, 3Laboratory of Membrane Trafficking Mechanisms, Department of Developmental Biology and Neurosciences, Graduate School of Life Sciences,Tohoku University, 4Departments of Pathology and of Microbiology and Immunology and Sean N. Parker Center for Allergy and Asthma Research, School of Medicine,Stanford University

Summary

Aquí detallamos un método para obtener imágenes de células vivas de exocitosis regulada. Este método utiliza FITC-los dextranos, que se acumulan en orgánulos relacionados con los lisosomas, como reportero. Este sencillo método permite también distinguir entre los diferentes modos de exocitosis regulada en las células que son difíciles de manipular genéticamente.

Abstract

Regulada de la exocitosis es un proceso que carga, que se almacena en gránulos secretores (SGs), se libera en respuesta a un gatillo secretora. Regulada de la exocitosis es fundamental para la comunicación intercelular y es un mecanismo clave para la secreción de neurotransmisores, hormonas, mediadores inflamatorios y otros compuestos, por una variedad de células. Se conocen al menos tres mecanismos distintos para exocitosis regulada: exocitosis completo, donde un solo SG completamente se fusiona con la membrana plasmática, exocitosis de beso-y-run, donde un solo SG transitoriamente se fusiona con la membrana plasmática, y exocitosis compuesto, donde SGs varios fusionan, antes o después de la fusión de la SG con la membrana plasmática. El tipo de exocitosis regulada por una célula es dictado a menudo por el tipo de gatillo secretora. Sin embargo, en muchas células, un solo gatillo secretora puede activar varios modos de exocitosis regulada simultáneamente. A pesar de su abundancia e importancia a través de especies y tipos de la célula, los mecanismos que determinan los diferentes modos de secreción son en gran parte sin resolver. Uno de los principales retos en la investigación de los diferentes modos de exocitosis regulada, es la dificultad de distinguir entre ellos, así como exploración de por separado. Aquí describimos el uso de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano como reportero de exocitosis y celular directo imágenes, para diferenciar entre las diferentes vías de exocitosis regulada, centrándose en la exocitosis compuesto, basado en la robustez y duración de los eventos exocíticas.

Introduction

Regulada de la exocitosis es el mecanismo primario por el cual carga fácilmente hecho es liberado de una célula secretora en respuesta a un disparador específico. La carga está preformada y secuestrada en vesículas secretoras, en la que se almacena hasta un relés la señal para la liberación del contenido de la SGs. Diferentes tipos de señales pueden resultar en diferentes modos de exocitosis regulada, o diferentes modos de exocitosis regulada pueden ocurrir simultáneamente. Se conocen tres modos principales de exocitosis regulada: exocitosis completo, que consiste en la fusión completa de un solo gránulo secretor con la membrana plasmática; exocitosis de beso-y-funcione, que consiste en la fusión transitoria del gránulo secretor con la membrana plasmática seguida por su reciclado; y exocitosis compuesta, que se caracterizaron por homotípicos fusión de varios SGs antes (es decir, multigranular exocitosis) o secuencial (es decir, exocitosis secuencial) a la fusión con la membrana plasmática1. Exocitosis compuesto se consideran el modo más extenso de carga release2, como permite la secreción rápida de la carga, la incluida del SGs que se encuentra distal de la membrana plasmática. Compuesto exocitosis se ha documentado en ambas células exocrinas y endocrinas3,4,5,6,7,8,9, así como en células inmunes. En las células inmunes, como los eosinófilos10,11,12 y neutrófilos13, exocitosis compuesto permite la liberación de mediadores que se requieren para matar a patógenos invasores tales como rápida y robusta bacterias o parásitos. Las células del mástil (MCs) desplegar compuesto exocitosis para la eficiente liberación de mediadores inflamatorios depositados durante la respuesta inmune innata, anafilaxia y otras reacciones alérgicas14,15,16 , 17. puesto que los diferentes modos de exocitosis pueden ocurrir simultáneamente18,19, se ha convertido en un reto para distinguir entre ellos en tiempo real o para identificar sus maquinarias de fusión respectivos, por lo tanto, la aclaración sus mecanismos subyacentes.

Aquí presentamos un método, basado en células vivas imágenes de celular cargado FITC-los dextranos, que permite el seguimiento en tiempo real de eventos exocíticas y distinguir entre sus diferentes modos. En particular, nuestro método permite el control exclusivo de exocitosis compuesto.

FITC-dextrano es un conjugado de fluoróforo sensible al pH FITC con el dextrano polisacárido de glucano. Fluorescencia de etiquetado dextranos han demostrado entrar en la célula micropinocytosis20,21 y macropinocitosis22,23. Como compartimentos endocíticos maduran hasta convertirse en lisosomas, se ha demostrado que FITC-los dextranos se acumulan en los lisosomas con sin degradación aparente. Sin embargo, desde FITC es un fluoróforo altamente sensibles al pH24, y el lumen del lisosoma es ácido, fluorescencia FITC-los dextranos apaga al llegar a la24del lisosoma. Por lo tanto, establecer dextranos como lisosoma dirigida la carga, junto con la sensibilidad del pH del FITC, han sentado las bases para el uso de FITC-los dextranos en estudios de lisosoma exocitosis25,26,27 , 28 , 29.

En varios tipos celulares, incluyendo MCs, neutrófilos, eosinófilos, células de T citotóxicas, melanosomas y otros, el SGs Mostrar características lisosomales y se clasifican como organelos relacionados con el lisosoma (LROs) o lisosomas secretores30,31 . Desde LROs tiene un pH ácido luminal, FITC-los dextranos pueden utilizarse para visualizar su exocitosis, como resultado de pH mayor asociado con la exteriorización de los LROs. De hecho, FITC-los dextranos se ha utilizado para monitorear la exocitosis en MCs18,32,33. En este método, FITC-los dextranos es agregado a la cultura de célula, tomado por las células por pinocitosis y clasificó en el SGs. Como es en los lisosomas, fluorescencia FITC se apaga en el SGs cuando están dentro de la célula. Sin embargo, en fusión con la membrana plasmática y la consecuente exposición al ambiente externo en SG, el FITC-los dextranos recupera su fluorescencia como el SG pH se levanta, permitiendo que el simple seguimiento de eventos exocíticas por microscopía de células vivas. Aquí, hemos ajustado este método para activar el seguimiento exclusivo de exocitosis compuesto.

Otros dos métodos se han utilizado previamente para seguimiento compuesto exocitosis. La microscopia electrónica fue el primer método para caracterizar estructuras exocíticas que sugirieron la ocurrencia de los diferentes modos de exocitosis. En particular, observaciones de “túneles secretoras” en las células acinares pancreáticas34 y MCs35,36,37 dieron lugar a la hipótesis de exocitosis compuesto. Sin embargo, mientras que la alta resolución de la microscopía electrónica tiene el poder de revelar las vesículas fusionadas, no puede seguir la dinámica de la fusión y por lo tanto no es posible definir si corresponden a la fusión de SG durante la exocitosis compuesto o la fusión de gránulos recapturados siguiendo su endocitosis. Este obstáculo es superado en otros métodos que pueden medir la exocitosis en las células vivas, tales como medidas de abrazadera de remiendo de la membrana plasmática capacitancia11,13,38,39 o Amperometría 40 de los medios de comunicación. Sin embargo, parche de sujeción requiere una instalación especial y puede no ser adecuado para todos los tipos de la célula. Amperometría medidas son capaces de rastrear exocitosis solamente si la carga se libera en las proximidades de los electrodos. Por lo tanto, usando proyección de imagen de células vivas ofrece una ventaja sobre estos métodos, permite no sólo para seguimiento en tiempo real de exocitosis, pero también permite la adquisición rápida y sencilla de los datos de la célula entera.

El seguimiento de FITC-los dextranos por microscopía de células vivas también ofrece algunas ventajas a otras células vivas métodos basados en la proyección de imagen. Por ejemplo, un método ampliamente usado es la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) de células cargado con una sonda fluorescente de SG o expresando un fluorescente etiquetado proteína SG carga o membrana proteína26,41, 42 , 43. la fuerza de este método radica en su capacidad para supervisar exclusivamente los sucesos que ocurren cerca de la membrana plasmática (en adelante como huella), por lo tanto eventos exocíticas. Sin embargo, esto es también el inconveniente de este método porque sólo la fracción celular que está al lado del cubreobjetos y cerca de la lente del microscopio puede ser había reflejada44. Si esas huellas representan de hecho la superficie de la membrana de la célula entera es todavía discutible45,46,47. En este sentido, utilizando un tinte pH-sensible como FITC-los dextranos y un microscopio estándar de fluorescencia o un microscopio confocal con un agujero de alfiler abierto permite la proyección de imagen de la célula entera, así capturar los eventos de total exocíticas que ocurren en ese celular.

Adicionales reporteros sensibles al pH que se utilizan para el estudio de exocitosis regulada por proyección de imagen de células enteras o TIRFM incluyen carga de SG o SG membrana proteína fusionada a phlourin, una variante de la GFP de pH-sensible. Los ejemplos incluyen NPY – phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin y synapto phluorin48,49,50,51,52. Mientras que la expresión de estas puntas de prueba puede representar más de cerca la composición endógena de las SGs, conlleva la transfección de las células y por lo tanto puede ser menos adecuado para las células que son difíciles de transfectar. Por lo tanto, cuando estudiando las células son difíciles de transfectar o bajo condiciones experimentales que requieren múltiples manipulaciones genómicas, es ventajoso el uso de un compuesto que puede ser suplido simplemente en el medio de cultivo celular, como FITC-los dextranos, . FITC-los dextranos también ofrece una ventaja sobre naranja de acridina (AO), otro tinte pH-sensible que ha sido utilizado para el rastreo de la exocitosis por celular vivo microscopia53,54,55,56 , 57 , 58. AO se ha demostrado para inducir la fotólisis de vesículas que dan lugar a destellos falsos, que no corresponden a la secreción real procesos de27. Por el contrario, FITC-los dextranos reflejan mejor eventos de secreción, probablemente debido a su baja producción foto-inducida del oxígeno reactivo27.

En particular, un enfoque alternativo para el estudio de exocitosis es mediante el seguimiento de la afluencia de un tinte, desde el medio exterior en la SG a través del poro de fusión que se abre durante este proceso. En este caso, el tinte se agrega al medio externo junto con el gatillo secretora. Entonces, cuando se abra el poro de fusión, el tinte se difunde en el SG59,60. Una clara ventaja de este método es que también ofrece la capacidad para estimar el tamaño del poro de fusión, mediante el uso de tintes de tamaño variable. Por ejemplo, dextranos de distinto peso molecular (MW), conjugado con diferentes fluoróforos, pueden utilizarse como colorantes extracelulares por el que el tamaño máximo de dextrano que puede penetrar la SG correspondería al tamaño del poro de fusión59, 61 , 62 , 63 , 64. Además, este enfoque no requiere el uso de una sonda de pH-sensibles. Sin embargo, una desventaja significativa es que la relación señal a ruido es muy baja, ya que una gran cantidad de colorante está presente en los medios de comunicación durante la adquisición de imágenes, resultando en la euforia.

En general, el uso de FITC-los dextranos como marcador para la exocitosis supera varios inconvenientes en métodos previamente divulgados, como señal a ruido ratio, toxicidad, seguimiento dinámico y complejidad.

Aquí describimos el uso de FITC-los dextranos supervisar exocitosis compuesta en la línea de la célula de mástil 3 RBL – 2H (en adelante como RBL, establecido principalmente por Eccleston et al. 65 y más clonados por Barsumian et al. 66), en respuesta a la inmunoglobulina E (IgE) / activación de antígeno (Ag).

Protocol

1. preparaciones Preparación de medios de cultivo RBL Mezclar 500 mL de glucosa baja Dulbecco había modificado medio de águila (DMEM) con 56 mL de suero bovino fetal (FBS), 5,5 mL de solución de penicilina-estreptomicina-nistatina, 5,5 mL de la solución de L-glutamina 200 mM. Esto da lugar a glucosa baja DMEM suplementado con 10% FBS, estreptomicina 100 μg/mL, 100 unidades/mL de penicilina, 12 nistatina unidades/mL y 2 mM L-glutamina. Filtro de los medios de comunicación mediante el us…

Representative Results

Figura 1a se representa esquemáticamente cómo FITC-los dextranos pueden actuar como reportero para regulada de la exocitosis y recapitular los diferentes modos de eventos exocíticas. En primer lugar, las células se incuban con FITC-los dextranos, que es internalizado por pinocitosis y ordenados para el SGs. Puesto que el SGs de MCs LROs, su bajo pH amortigua la fluorescencia del FITC, se muestra gránulos negros (A-C, I). Cuando las células se activan po…

Discussion

Aquí describimos cómo traza la fluorescencia de FITC-los dextranos en SGs puede utilizarse para capturar específicamente compuesto exocitosis eventos. Esto se logró mediante el ajuste del microscopio para adquirir una imagen cada 15 segundos, asegurando que se registrarán sólo eventos de larga duración en el tiempo y por lo tanto excluyendo eventos cortos que corresponderían a la exocitosis completo o exocitosis de beso-y-funcione. Para establecer el método, nos demostró caída de las Rab5 isoformas que se expr…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al Dr. U. Ashery el regalo generoso de cDNA. Agradecemos a los Drs. G. Mass, L. Mittleman, M. Shaharbani y Y.Zilberstein de Sackler celular & Molecular Imaging Center por su inestimable asistencia con microscopía. Este trabajo fue apoyado por la binacional Estados Unidos-Israel Science Foundation (grant 2013263 R. Sagi-Eisenberg, I. Hammel y S.J.Galli) y conceder 933/15 de la Israel Science Foundation, fundada por la Academia de Israel de Ciencias (R.Sagi-Eisenberg ) y las subvenciones de NIH U19 AI 104209 y AR067145 R01 (a S.J. Galli).

Materials

DMEM low glucose Biological Inductries 01-050-1A
Fetal bovine serum Gibco 12657
Pen-strep-nystatin solution Biological Inductries 03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution  Biological Inductries 03-020-1A
FITC dextran 150K Sigma-Aldrich 46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution B Biological Inductries 03-052-1A Warm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size  Sigma-Aldrich CLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore size Sartorius 16534K
Chambered coverglass  Thermo scientific 155411
Corning tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4503
Anti-DNP monoclonal IgE Sigma-Aldrich D8406
DNP-HSA (Ag) Sigma-Aldrich A6661  Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4 Biological Inductries 03-025-1B
CaCl2 MERK 102382
Glucose BDH Laboratories 284515V
Ammonium chloride MERK 1145
PIPES dipotassium salt Sigma-Aldrich 108321-27-3
Calcium acetate hydrate Sigma-Aldrich 114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate) Sigma-Aldrich G1501
NaH2PO4 MERK 6346
NaCl MERK 106404
MgCl2 MERK 105833
KCl MERK 104936
Electroporator  BTX ECM830
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 5 Pascal, Axiovert 200M Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 800, Axio Observer.Z1 /7 Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Leica Leica SP5 Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cells RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67
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Klein, O., Roded, A., Hirschberg, K., Fukuda, M., Galli, S. J., Sagi-Eisenberg, R. Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis. J. Vis. Exp. (136), e57936, doi:10.3791/57936 (2018).
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