Her presenterer vi en protokoll for å undersøke larver sebrafisk og fathead ørekyte locomotor og photomotor svar (PMR) bruker en automatisert sporing. Når innarbeidet felles toksikologi bioassay, gi analyser av disse virkemåtene et diagnostisk verktøy for å undersøke kjemiske bioactivity. Denne protokollen er beskrevet ved hjelp av koffein, en modell neurostimulant.
Fisk modeller og atferd blir vanligere i biomedisinsk vitenskapene; imidlertid har fisk lenge vært gjenstand for økologiske, fysiologiske og toksikologiske studier. Ved hjelp av automatisert digital sporing plattformer, siste innsats i neuropharmacology er å utnytte larver fisk locomotor atferd for å identifisere potensielle terapeutiske mål for romanen små molekyler. Ligner på disse anstrengelser, forskning i Miljøfag og komparativ farmakologi og toksikologi undersøker ulike atferd av fisk modeller som diagnoseverktøy i lagdelt evaluering av miljøgifter og real-time overvåkning av overflatevann for miljøgifter trusler. Mens sebrafisk er en populær larver fisk modell i biomedisinsk vitenskapene, er fathead ørekyte en vanlig larver fisk modell økotoksikologi. Dessverre, fathead ørekyte Larvene har fått betydelig mindre oppmerksomhet i atferdsmessige studier. Her vi utvikle og demonstrere en opptreden profil protokoll med koffein som en modell neurostimulant. Om photomotor svar av fathead ørekyte ble noen ganger berørt av koffein, sebrafisk var markert mer følsom for photomotor og locomotor sluttpunkter, som svarte på miljømessig relevante nivåer. Fremtidige studier er nødvendig å forstå sammenlignende atferdsmessige følsomhet forskjeller fisk med alder og tid på dagen, og avgjøre om liknende atferd effekter skulle oppstå i naturen og angivende for uønskede resultater på enkelt eller innbyggere nivåer av biologisk organisasjon.
Selv om fisken modeller brukes stadig mer for biomedisinsk studier, har fisk vært rutinemessig ansatt for økologi og fysiologi studier, undersøke forurensning av overflatevann og forstå toksikologiske terskler av kjemikalier. Slikt arbeid er viktig fordi kjemisk forurensning kan svekke akvatiske økosystemer og svekker kvaliteten på kilde vannforsyninger1,2. De fleste av kjemikaliene i handel, men mangel selv grunnleggende toksikologi informasjon3.
Dyremodell analyser tradisjonelt brukt i regulatoriske toksisitet testing er ressurskrevende og kan ikke gi den høy gjennomstrømningen, tidlig tier screening nødvendig for toksisitet i 214. Deretter er det en voksende drivkraft å vedta og bruke i vitro modeller som kan mer raskt og effektivt skjermen forbindelser for biologiske aktiviteter3,5. Om cellen basert modeller presenterer mange muligheter, de mangler ofte biologiske kompleksiteten, og dermed ikke gjøre rede for mange viktige hele organismen prosesser, inkludert metabolisme6.
Sebrafisk er en vanlig biomedisinsk dyr modell som står popularitet som en alternativ modell i akvatiske toksikologi og økotoksikologi7,8. Gitt deres liten størrelse, rask utvikling, og høy fruktbarhet, kan fisk modeller brukes til raskt og effektivt skjermen kjemikalier for bioactivity og toksisitet hele organismen skala9. Ved hjelp av automatiserte sporing gir larver sebrafisk atferd forbedret diagnostiske verktøy i screening forurensninger for toksisitet10,11. Studier i farmasøytiske realfag har vist at locomotor endepunktene er informativ av kjemiske virkningsmekanismer, kan brukes til fenotypen atferd, og deretter kan foreløpig identifisere subcellular mål for romanen molekyler12, 13. Mens sebrafisk er en populær larver fisk modell i biomedisinsk vitenskapene, fathead ørekyte er en felles, økologisk viktige fisk modell som brukes for økotoksikologi studier og under potensielle (f.eks nye kjemiske evalueringer) og retrospektiv (f.eks ambient overflatevann eller avløpsvann avløpsvann utslipp overvåking) miljømessige vurderinger. Dessverre, atferdsmessige responser av larver fathead ørekyte fått betydelig mindre oppmerksomhet enn sebrafisk. Våre pågående forskning med to vanlige larver fisk modeller, sebrafisk og fathead ørekyte, antyder at larver fisk som svømmer mønstre vises unike til forventet eller virkningsmekanismer for ulike kjemikalier. Dermed gir atferdsmessige endepunktene potensial raskt og følsomt undersøke kjemikalier for toksisitet og identifisere subcellular mål for industriell kjemiske og andre forurensninger, spesielt under tidlig tier vurderinger.
Her rapporterer vi en protokoll for å undersøke behavioral respons profiler i larver fisk. Vi viser metodene koffein, en modell neurostimulant og en felles vannlevende miljøgifter som er introdusert til akvatiske systemer gjennom utslipp fra avløpsvann behandlinger planter etter konsum av matvarer, drikkevarer, og legemidler formulert med koffein14. Vi undersøker atferdsmessige responser til koffein i begge larver sebrafisk og fathead ørekyte, inkludert en brå endring i lysforhold, som ofte omtales som photomotor svar (PMR) under farmasøytiske studier med embryonale og larver sebrafisk13,15. Vi identifisere ytterligere effektene av koffein på tvers av flere locomotor endepunktene å utvikle kjemisk reaksjon profiler for hver fisk modell. Koffein behandling nivåer i denne studien representerer den øvre centiles av eksponering distribusjoner basert på miljømessige måleverdiene koffein16. Vi har også behandlinger benchmarked larver fisk LC50 verdier og terapeutiske fare verdien (THV), en farmasøytisk konsentrasjon i vann som er forventet for å resultere i Plasmanivåer i fisk samsvar med en menneskelig terapeutiske plasma dose.
Når du velger kjemisk behandling nivåer for atferdsdata toksikologi studier, må flere faktorer vurderes. Koffein behandling nivåer studien ble valgt basert på øvre centile verdier for spådd miljømessige eksponering scenarier fra avløpsvann avløpsvann16. Når velger vi rutinemessig behandling nivåer for vannlevende toksikologi studier med probabilistisk eksponering vurderinger av miljømessige observasjoner19,20,21. En THV, som er calculable for medisiner, var inkludert som en behandling studien. THV verdier (Eq. 1)22,23 defineres som spådde vann konsentrasjoner fører til menneskelig terapeutiske doser (Cmax) av legemidler i fisk23, er inspirert av første plasma modellering innsats24og er beregnet basert på blod: vann kjemiske partisjonering koeffisientene (Eq. 2)25.
THV = Cmax / logge PBW (Eq. 1)
logge PBW = Logg [(100.73. logge Kow · 0,16) + 0.84] (Eq. 2)
Her, velge vi også sublethal behandling nivåer i forhold til sebrafisk og fathead ørekyte LC50 verdier. Vi anser denne tilnærmingen benchmarking fremgangsmåten for atferdsdata svar, spesielt når du sammenligner terskler av spesifikk atferd med en fisk over flere kjemikalier. Den letter ytterligere beregninger av akutt til kronisk prosenter, som kan være diagnostically nyttig i akvatiske toksikologi for mekanistisk studier og vurderinger. LC50 verdier Hentet fra foreløpig toksisitet bioassay følge standardiserte retningslinjene i trinn 2.1.
I denne protokollen, vi bruker vanlige eksperimentell design og statistiske teknikker anbefalt av det amerikanske EPA og OECD standardiserte metoder for toksikologi studier med fisk modeller. Selv om vi rapportere p -verdier (f.eks., < 0,01, < 0,05, < 0,10), betydelige forskjeller (α = 0,10) i aktivitet identifiseres nivåer blant behandlinger bruker variansanalyse (ANOVA) hvis normalitet og likeverdig varians forutsetninger er oppfylt. Dunnetts eller Tukeys "HSD" post hoc tester utføres for å identifisere behandling nivå forskjeller. Vi velger dette alpha (α = 0,10) verdi å redusere type II feil, spesielt for tidlig tier analyser og når en forståelse av biologisk viktig effekt størrelsen begrenses for lite studert atferdsmessige endepunkter og modell organismer26, i stedet for ansette prosedyrer mer vanlig i biomedisinsk vitenskapene for flere sammenligninger (f.eks., Bonferroni korreksjon for RNA-Seq data)27. Fremtidige studier for å forstå variasjon av disse atferdsdata svar og potensielt endre eksperimentell design (f.eks, øke replikering) tilsvarende.
En rekke faktorer kan påvirke atferden til larver fisk i tillegg til kjemisk eksponering. For eksempel tid, alder, godt størrelse, temperatur, lysforhold og volumet av eksponering løsning i hver godt representerer viktige hensyn11,30. For disse grunner, bør forholdsregler tas til effekten av eksterne faktorer som kan påvirke locomotor oppførsel av larver under eksperimentering. Atferdsmessige observasjoner skal utføres i smale tidsvinduer (3 til 4 h) og over tidsperioder når tid av dag effekter forventes å ha minimal påvirkning på larver locomotor atferd11. I tillegg skal larver fisk vedlikeholdes på en jevn temperatur (28 ± 1 ° C i sebrafisk) og 24 ± 1 ° C for FHM og på en definert lys/mørke syklus i temperaturkontrollerte inkubatorer gjennom eksponeringen perioden. I tillegg bør temperaturen i laboratoriet hvor atferd registreres opprettholdes forhold tilnærmelsesvis eksperimentelle forhold å unngå temperatur påvirkninger på atferd. Videre bør brønner brukes under atferdsmessige observasjoner opprettholdes med konsistent volum for hver enkelt fisk.
Larver og embryonale sebrafisk PMR har tidligere blitt brukt i biomedisinsk vitenskapene for å identifisere potensielle terapeutiske mål for romanen forbindelser12,13. Denne protokollen bygger på tidligere atferdsdata forskning med sebrafisk ved å bruke 38 endepunktene for å undersøke kjemiske bioactivity av miljøgifter. Selv om koffein er en felles vannlevende miljøgifter med en forstått virkningsmekanismen (MoA), mangler mange forbindelser i handel viktige mekanistisk data. Denne protokollen kan derfor brukes til å få innsikt i MoAs for forbindelser mangler toksisitet data, inkludert kommersielle kjemikalier39. Videre gir protokollen metoder for to av de mest brukte fisk modellene. Som nevnt tidligere, mens sebrafisk er en felles modell som biomedisinsk fisk som blir stadig mer populær i økotoksikologi, fathead ørekyte brukes vanligvis som en økologiske modell for miljøvurdering programmer men har mottatt forholdsvis mindre oppmerksomhet i atferdsmessige studier med automatiserte systemer sammenlignet sebrafisk. Men det er fortsatt ingen standardisert regulatoriske metoder for fisk atferdsmessige toksikologi studier, gir denne protokollen en tilnærming for å støtte arbeidet.
Koffein vakte atferdsdata svar i fisk modellene på nivåer som er oppdaget i vannmiljøet16. Rodriguez-Gil et al. 2018 utviklet globale miljømessige eksponering distribusjoner i akvatiske systemer basert på måleverdiene koffein16. Spesielt ville 95% av spådd avløpsvann avløpsvann konsentrasjoner falle under LOECs for de mest sensitive atferdsmessige endepunktene på sebrafisk og fathead ørekyte studien (tabell 2). Selv om flere atferdsmessige effektene av koffein ble observert i sebrafisk (spesielt i mørke forhold) på miljømessig relevante nivåer, er det uklart om disse atferdsmessige endringer kan oppstå i naturlige fiskebestandene eller føre økologisk viktige uønskede resultater. Selv om det er nyttig for følsom, diagnostiske screening formål, kanskje ikke larver fisk atferdsmessige terskler representant andre livshistorie faser eller fisk i naturlige populasjoner. Videre forskning er berettiget til å bestemme om lignende behavioral respons terskler ville oppstå i naturen og angivende for uønskede resultater på de enkelte eller befolkningen nivåene av biologisk organisasjon.
The authors have nothing to disclose.
Støtte for denne studien ble gitt av US National Science Foundation (prosjekt #: CHE-1339637) med ekstra støtte fra det amerikanske Environmental Protection Agency. Vi takker Dr. Jone Corrales, Dr. Lauren Kristofco, Gavin Saari, Samuel Haddad, Bekah Burket og Bridgett Hill for generelt laboratorie-støtte.
ViewPoint Zebrabox | ViewPoint | ZebraLab and ZebraLab platform for automated behavioral observations | |
Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-100G | Study chemical |
Incubator | VWR | 9110589 | Maintains light/dark cycle and temperature for fathead minnow experiments |
Incubator | Thermo Fisher Scientific | 35824-636 | Maintains light/dark cycle and temperature for zebrafish experiments |
100 ml glass beakers | VWR | 89000-200 | Zebrafish exposure chambers |
500 ml glass beakers | Pyrex | EW-34502-03 | Fathead minnow exposure chambers |
5000 µl auto-pipette | Eppendorf | Research 5000 | Used to fill individual wells in well plates |
Transfer Pippettes | VWR | 414-004-004 | Used to transfer study organisms |
48-well plates | Fisher Scientific | 08-772-52 | Larval zebrafish behavioral recording chambers |
24-well plates | VWR | 10062-896 | Larval fathead minnow behavioral recording chambers |
Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | For reconstituted hard water |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | For reconstituted hard water |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | For reconstituted hard water |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | For reconstituted hard water |
z-mod recirculating system | Marine Biotech Systems | Recirculating system to maintian zebrafish cultures | |
Statistical analysis software | Sigma Plot | Version 13.0 | Used to analyze beahvioral data and produce figures |
Statistical analysis software | Graphpad Prism | Prism 5 | Used to produce figures |
Autosampler/quaternary pumping system | Agilent Technologies | Infinity 1260 model | Analytical verification of caffeine treatment levels |
Jet stream thermal gradient electrospray ionization source | Agilent Technologies | Analytical verification of caffeine treatment levels | |
Triple quadrupole mass analyzer | Agilent Technologies | Model 6420 | Analytical verification of caffeine treatment levels |
10 cm × 2.1 mm Poroshell 120 SB-AQ column (120Å, 2.7) | Agilent Technologies | 685775-914T | Caffiene chromatography |
MassHunter Optimizer Software | Agilent Technologies | Determine the ionization mode, monitored transitions, and instrumental parameters for caffeine/caffeine-d9 and paraxanthine/paraxanthine-d6 |