Leaf Spray massespektrometri: En hurtig omgivende ionisering teknik til direkte vurdere metabolitter fra plantevæv
Summary
Leaf spray massespektrometri er en direkte kemisk analyse teknik, der minimerer forberedelsen af prøver og eliminerer kromatografi, giver mulighed for hurtig påvisning af små molekyler fra plantevæv.
Abstract
Planter producerer tusindvis af små molekyler, der er forskellige i deres kemiske egenskaber. Massespektrometri (MS) er en effektiv teknik til at analysere plante metabolitter, fordi det giver Molekylær vægte med høj følsomhed og specificitet. Leaf spray MS er en omgivende ionisering teknik hvor plantevæv bruges til direkte kemisk analyse via electrospray, fjerne kromatografi fra processen. Denne tilgang til prøveudtagning metabolitter giver mulighed for en bred vifte af kemiske klasser skal påvises samtidigt fra intakt plantevæv, minimere mængden af prøveforberedelse nødvendigt. Når det bruges med en høj opløsning, nøjagtige masse MS, muliggør leaf spray MS en hurtig opdagelse af metabolitter af interesse. Det er også muligt at indsamle tandem masse opsplitning data med denne teknik til at lette en sammensatte identifikation. Kombinationen af nøjagtige masse målinger og fragmentering er gavnlige i bekræfter sammensatte identiteter. Leaf spray MS teknik kræver kun mindre ændringer til en nanospray ionisering kilde og er et nyttigt redskab til at udvide funktionerne i et massespektrometer. Her, analyseres friske blade væv fra Sceletium tortuosum (Aizoaceae), en traditionel medicinsk plante fra Sydafrika, talrige mesembrine alkaloider er registreret med blad spray MS.
Introduction
Planter indeholder en bred vifte af små molekyler med forskellige kemiske egenskaber. MS er en effektiv teknik til at analysere plante-forbindelser, fordi det kan give elementært kompositioner med en høj følsomhed og specificitet for detektion og identifikation af metabolitter1. Mest almindeligt, er MS udført på opløsningsmiddel-ekstraherede prøver, som er adskilt af kromatografi før MS analyse1. Men brugen af væskekromatografi (LC) kræver langvarig analyse gange og er ofte forbundet med en omfattende stikprøve forberedelse1. Derimod er direkte kemisk analyse af intakt væv, der omgår kromatografi en meget hurtig teknik, der kræver minimal prøve forberedelse2. Således, i tilfælde hvor kromatografiske trin kan være betalbare, en direkte kemisk analyse kan være meget fordelagtige.
Typiske LC-MS til naturlige produkter og metabolomics forskning bygger på lange bulk ekstraktioner af tørrede eller frosne plantematerialer som indeholder flere væv og celler typer3. Alternativt kan direkte kemisk analyse, såsom MS påvisning af metabolitter fra plantevæv, isolere celletyper og undgå forberedelse artefakter4. Leaf spray MS, også benævnt væv-spray5,6, er en direkte omgivende ionisering MS teknik, som kræver stort set ikke prøve forberedelse5,7. Leaf spray MS er nært beslægtet med papir spray MS, en omgivende ionisering teknik med Karakteristik af electrospray Ionisation, der giver mulighed for påvisning af analysander, der er deponeret på papir7. På trods af navnet, leaf spray MS gælder for forskellige typer af plantevæv, ikke bare blade, og har været vist på frugt, frø, rødder, blomster væv og knolde, blandt andre6,8,9, 10,11,12. Teknikken letter ionisering af endogene fytokemikalier direkte fra plantematerialer i massespektrometer til registrering af8. Leaf spray MS kan også give oplysninger om den geografiske fordeling af kemikalier i forskellige vævstyper i planter13. Sammenlignet blad spray MS med opløsningsmiddelekstraktion og LC-MS, tyder resultaterne blad spray MS giver mulighed for hurtig påvisning af overflade metabolitter fra unikke celletyper såsom trichomes13. Figur 1 illustrerer blad spray MS eksperimentelle set-up. Direkte electrospray Ionisation opstår efter kun mindre kilde ændringer. En høj spænding er anvendt til plantevæv via en metal klemme, producerer en spray af meget ladet dråber danner en Taylor kegle, der bærer ioner til ion indløb af MS. Electrospray ionisering opstår fra den naturlige væske af planten eller fra de opløsningsmiddel appl IED plante overflade. En spids på væv letter electrospray og kan være naturligt forekommende eller skabt ved at skære.
Leaf spray MS er en hurtig metode til kvalitativ og semi-kvantitative analyse af intakt plantevæv, der har fundet nytte for en bred vifte af applikationer. For eksempel er teknikken blevet brugt til at opdage endogene stoffer til at skelne mellem beslægtede arter, og endda til at vurdere ændringer i de samme arter dyrkes under forskellige betingelser. Tidligere undersøgelser har vist denne tilgang ved at måle metabolitter i beautyberry (Callicarpa L.) 12 og amerikansk ginseng (Panax quinquefolium L.) 6. i sidstnævnte eksempel Ginsenosider, aminosyrer og oligosaccharider kunne påvises efter befugtning rå ginseng væv. Vilde og dyrkede amerikansk ginseng blev differentieret fra knold skiver6. Ginseng knold integritet var bevaret efterfølgende blad spray MS, hvilket gav mulighed for en senere morfologiske og mikroskopisk kontrol6. Derudover kan eksogen forbindelser på planten prøver også påvises. En række pesticider (acetamiprid, diphenylamin, imazalil, linuron og thiabendazol) er blevet opdaget på skræl eller papirmasse af frugt og grøntsager9. Mens disse undersøgelser og mange andre har vist nytten af blad spray MS til forskellige specifikke formål, har en detaljeret protokol ikke tidligere indberettet.
Her, vil protokol beskrivelse ikke fokusere på optimering af metoden for en specifik væv eller sammensatte. Snarere, påvisning af mesembrine alkaloider fra Sceletium tortuosum (L.) N.E.Br. (Aizoaceae) bruges som et eksempel til at diskutere de nødvendige optimering foranstaltninger, der skal træffes, når du opretter et blad spray MS eksperiment for en art, væv, eller forbindelser for første gang. S. tortuosum er en saftige endemiske til regionen halvtørre Karroo i Sydafrika. En traditionel medicin af San og Khoi Khoi folk, det blev brugt til appetit og tørst undertrykkelse såvel som for dets psykotrope og smertestillende effekter14,15. I øjeblikket, anvendes standardiserede ekstrakter til behandling af neuropsykiatriske og neuropsykologiske forstyrrelser16,17. De primære forbindelser af interesse omfatter alkaloid mesembrine og derivater heraf, hvoraf mange er også fundet i relaterede Sceletium arter15. Både vilde og dyrkede populationer af S. tortuosum har varierende koncentrationer af mesembrine alkaloider, således præsentere en kvalitetskontrol udfordring18. En metode til hurtig påvisning af mesembrine alkaloider, såsom blad spray MS, kan være nyttige i overvågningen Sceletium produkter. Fordi tidligere var der ingen detaljerede visuelle forsøgsplan for blad spray MS teknik, vi vil illustrere metoden ved hjælp af eksemplet med S. tortuosum, og følgende er beskrevet: ændring af et nanospray kilde, den udvælgelse og forberedelse af plantevæv, erhvervelse af data, fortolkning af resultaterne, og optimering af MS parametre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vellykket brug af denne protokol er baseret på optimering af forskellige trin for plantearter, vævstype og target forbindelser af interesse. De parametre, der er beskrevet i protokollen giver et godt udgangspunkt. De følgende eksperimentelle beslutninger skal være fremstillet og testet: eller ej til brug (1) klip eller uncut væv og (2) opløsningsmidlet eller ingen opløsningsmidler, (3) hvad opløsningsmiddel til at bruge og i hvilken mængde (4) hvad afstand af væv fra ion-fjorden skal være , og (5) spænding am…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af NSF plante Genome Research Program grant IOS-1238812 og postdoc stipendium i biologi IOS-1400818. Arbejdet blev også finansieret af et Monsanto Graduate studerende stipendium til Katherine A. Sammons. Fulbright afrikanske forsker lærde Program (2017-2018) er takkede for finansieringen tildeles Nokwanda P. Makunga. Vi værdsætter donation af en nanospray kilde fra Jessica Prenni og Proteomics og Metabolomics anlægget ved Colorado State University.
Materials
| Conn Pin | Digi-Key elctronics | WM2563CT-ND | pin will insert into Thermo Scientific source to provide voltage |
| small clamp | Digi-Key elctronics | 314-1018-ND | CLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A |
| large clamp | Digi-Key elctronics | 290-1951-ND | ALLIGATOR CLIP NARROW NICKLE 5A |
| Heat shrink | Digi-Key elctronics | Q2Z1-KIT-ND | to cover soldering joints |
| NSI source Nanospray Ion Source | Thermo scientific | NA | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument |
| Q Exactive- hybrid quadrupole Orbitrap | Thermo scientific | NA | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument |
| Tune Software | Thermo scientific | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument | |
| Xcalibur Software | Thermo scientific | ||
| Plant of interest – S. tortousum |
References
- Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography – mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical Biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
- Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Detection technologies. Ambient mass spectrometry. Science. 311 (5767), 1566-1570 (2006).
- Kim, H. K., Verpoorte, R. Sample preparation for plant metabolomics. Phytochemical Analysis. 21 (1), 4-13 (2010).
- Takats, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306 (5695), 471-473 (2004).
- Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
- Chan, S. L. -. F., Wong, M. Y. -. M., Tang, H. -. W., Che, C. -. M., Ng, K. -. M. Tissue-spray ionization mass spectrometry for raw herb analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 25 (19), 2837-2843 (2011).
- Wang, H., Liu, J., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Paper spray for direct analysis of complex mixtures using mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition. 49 (5), 877-880 (2010).
- Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: Direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
- Malaj, N., Ouyang, Z., Sindona, G., Cooks, R. G. Analysis of pesticide residues by leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 4 (7), 1913-1919 (2012).
- Snyder, D. T., Schilling, M. C., Hochwender, G., Kaufman, A. D. Analytical methods profiling phenolic glycosides in Populus deltoides and Populus grandidentata by leaf spray ionization tandem mass spectrometry. Analytical Methods. 7 (3), 870-876 (2015).
- Falcone, C. E., Cooks, R. G. Molecular recognition of emerald ash borer infestation using leaf spray mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (11), 1304-1312 (2016).
- Liu, J., Gu, Z., Yao, S., Zhang, Z., Chen, B. Rapid analysis of Callicarpa L. using direct spray ionization mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 124, 93-103 (2016).
- Freund, D. M., Martin, A. C., Cohen, J. D., Hegeman, A. D. Direct detection of surface localized specialized metabolites from Glycyrrhiza lepidota (American licorice) by leaf spray mass spectrometry. Planta. 247 (1), 267-275 (2018).
- Smith, M. T., Crouch, N. R., Gericke, N., Hirst, M. Psychoactive constituents of the genus Sceletium N.E.Br. and other Mesembryanthemaceae: a review. Journal of Ethnopharmacology. 50 (3), 119-130 (1996).
- Gerickea, N., Viljoen, A. M. Sceletium-a review update. Journal of Ethnopharmacology. 119 (3), 653-663 (2008).
- Terburg, D., et al. Acute effects of Sceletium tortuosum (Zembrin), a dual 5-HT reuptake and PDE4 inhibitor, in the human amygdala and its connection to the hypothalamus. Neuropsychopharmacology. 38 (13), 2708-2716 (2013).
- Coetzee, D. D., López, V., Smith, C. High-mesembrine Sceletium extract (TrimesemineTM) is a monoamine releasing agent, rather than only a selective serotonin reuptake inhibitor. Journal of Ethnopharmacology. 177, 111-116 (2016).
- Shikanga, E. A., et al. In vitro permeation of mesembrine alkaloids from Sceletium tortuosum across porcine buccal, sublingual, and intestinal mucosa. Planta Medica. 78 (3), 260-268 (2012).
- Pulliam, C. J., Bain, R. M., Wiley, J. S., Ouyang, Z., Cooks, R. G. Mass spectrometry in the home and garden. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (2), 224-230 (2015).
- Lawton, Z. E., et al. Analytical validation of a portable mass spectrometer featuring interchangeable, ambient ionization sources. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (6), 1048-1059 (2017).
- . GNPS Available from: https://gnps.ucsd.edu/ (2018)
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Ore, M. MZmine2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
- Meyer, G. M. J., Wink, C. S. D., Zapp, J., Maurer, H. H. GC-MS, LC-MS(n), LC-high resolution-MS(n), and NMR studies on the metabolism and toxicological detection of mesembrine and mesembrenone, the main alkaloids of the legal high "Kanna" isolated from Sceletium tortuosum. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (3), 761-778 (2015).
- Zhang, N., et al. Rapid detection of polyhydroxylated alkaloids in mulberry using leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 5 (10), 2455-2460 (2013).
- Pereira, I., et al. Rapid screening of agrochemicals by paper spray ionization and leaf spray mass spectrometry: which technique is more appropriate?. Analytical Methods. 8, 6023-6029 (2016).
- Zhang, J. I., Li, X., Cooks, R. G. Direct analysis of steviol glycosides from Stevia leaves by ambient ionization mass spectrometry performed on whole leaves. The Analyst. 137 (13), 3091-3098 (2012).
- Freund, D. M., Hegeman, A. D. Recent advances in stable isotope-enabled mass spectrometry-based plant metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 43, 41-48 (2017).
- Wurtzel, E. T., Kutchan, T. M. Plant metabolism, the diverse chemistry set of the future. Science. 353 (6305), 1232-1236 (2016).
