Espectrometría de masa de hoja aerosol: Una técnica rápida ionización ambiental evaluar directamente los metabolitos de los tejidos vegetales

Summary

Espectrometría de masas en aerosol foliar es una técnica de análisis químico directo que reduce al mínimo la preparación de la muestra y elimina la cromatografía, permitiendo la detección rápida de pequeñas moléculas de los tejidos vegetales.

Abstract

Las plantas producen miles de moléculas pequeñas que son diversas en sus propiedades químicas. Espectrometría de masas (MS) es una técnica poderosa para el análisis de metabolitos de la planta porque proporciona pesos moleculares con alta sensibilidad y especificidad. Hojas spray MS es una técnica de ionización ambiental donde el tejido de la planta se utiliza para análisis químico directo mediante electrospray, eliminación de cromatografía de proceso. Este enfoque de muestreo metabolitos permite una amplia gama de clases de químicos para detectar simultáneamente de tejidos de la planta intacta, minimizando la cantidad de preparación de la muestra necesitada. Cuando se utiliza con una alta resolución, precisa em masa, spray de hoja em facilita la detección rápida de metabolitos de interés. También es posible recopilar datos de tándem masas fragmentación con esta técnica para facilitar la identificación de una compuesto. La combinación de la fragmentación de las medidas exactas de masas es beneficiosa en confirmar identidades compuestas. La hoja técnica de MS requiere sólo pequeñas modificaciones a una fuente de ionización nanospray y es una herramienta útil para ampliar la capacidad de un espectrómetro de masas. Aquí, se analiza el tejido foliar fresco de Sceletium tortuosum (Aizoaceae), una planta medicinal tradicional de Sudáfrica, se detectan numerosos alcaloides mesembrine con spray de hoja em.

Introduction

Las plantas contienen una amplia gama de pequeñas moléculas con diferentes propiedades químicas. MS es una técnica poderosa para el análisis de compuestos de la planta porque puede proporcionar composiciones elementales con una alta sensibilidad y especificidad para la detección e identificación de metabolitos¹. Comúnmente, MS se realiza en muestras extraídos por solvente, que se separan por cromatografía de antes de la MS análisis¹. Sin embargo, el uso de la cromatografía líquida (LC) requiere tiempos de análisis muy largo y suele estar asociado con una muestra extensa preparación¹. En contraste, el análisis químico directo de tejidos intactos que elude la cromatografía es una técnica muy rápida, que requiere la preparación de la muestra mínimo². Así, en casos donde pasos cromatográficos pueden ser pérdidas, un análisis químico directo puede altamente ventajoso.

Típica LC-MS para la investigación de productos y metabolómica natural se basa en extracciones de largo a granel de materiales vegetales secos o congelados que contienen múltiples tejidos y células tipo³. Alternativamente, el análisis químico directo, como el MS la detección de metabolitos de tejido vegetal, puede aislar tipos celulares y evitar artefactos de preparación⁴. Spray de hoja em, también conocida como tejido en spray^5,6, es una técnica de ionización ambiental directa MS, lo que requiere esencialmente no muestra preparación^5,7. Spray de hoja EM se relaciona estrechamente con spray papel MS, una técnica de ionización ambiental con características de ionización de electrospray que permite la detección de analitos que se depositan sobre papel⁷. A pesar del nombre, hoja aerosol MS es aplicable a varios tipos de tejidos de la planta, no sólo las hojas y ha sido demostrado en fruta, semillas, raíces, tejidos florales y tubérculos, entre otros^{6,8,9, 10,11,12}. La técnica facilita la ionización de fitoquímicos endógena de las materias vegetales en el espectrómetro de masas para la detección de⁸. Aerosol de hoja em también puede proporcionar información sobre la distribución espacial de sustancias químicas en los tipos de tejidos diferentes en las plantas¹³. Aerosol de hoja em es comparación con extracción por solventes y LC-MS, los resultados sugieren spray hoja que MS permite la detección rápida de metabolitos superficie de tipos de la célula única como tricomas¹³. La figura 1 ilustra el montaje experimental de hoja aerosol MS. Ionización por electrospray directa se produce después de solamente modificaciones de menor importancia fuente. Un alto voltaje se aplica a los tejidos de la planta mediante una abrazadera metálica, produciendo un spray de gotas muy cargados formando un cono de Taylor que lleva los iones a la entrada de iones de la Sra. Electrospray ionización se produce desde el líquido natural de la planta o desde el solvente appl IED a la superficie de la planta. Una punta en el tejido facilita el electrospray y puede naturalmente que ocurren o creado por corte.

Hojas spray MS es un método rápido para el análisis cualitativo y semicuantitativo de tejidos vegetales intactos que han encontrado utilidad para una amplia variedad de aplicaciones. Por ejemplo, la técnica se ha utilizado para detectar compuestos endógenos para distinguir especies relacionadas e incluso a evaluar los cambios en las mismas especies cultivadas bajo diferentes condiciones. Estudios anteriores han demostrado este enfoque mediante la medición de metabolitos en Misisipí (Callicarpa L.) ¹² y ginseng americano (Panax quinquefolium L.) ⁶. en el último ejemplo, ginsenósidos, aminoácidos y oligosacáridos podrían detectarse después de mojar el tejido ginseng crudo. Ginseng americano silvestre y cultivado se diferenciaron del tubérculo rebanadas⁶. Integridad del tubérculo de ginseng fue preservado sucesivas spray de hoja em, que permitió una inspección morfológica y microscópica posterior⁶. Además, se pueden detectar compuestos exógenos en las muestras de la planta. Un número de pesticidas (acetamiprid, Difenilamina, imazalil, linurón y tiabendazol) se han detectado en la cáscara o pulpa de frutas y hortalizas⁹. Mientras que estos estudios y muchos otros han demostrado la utilidad de la pulverización de hojas MS para los varios propósitos específicos, un protocolo detallado no se ha divulgado previamente.

Aquí, la descripción del Protocolo no se centrará en la optimización del método de un tejido específico o compuesto. Por el contrario, la detección de alcaloides mesembrine de N.E.Br Sceletium tortuosum (L.). (Aizoaceae) se utiliza como ejemplo para discutir las medidas de optimización necesarias que deben tomarse cuando se configura un experimento de MS hoja aerosol para una especie, tejido, o establecidos por primera vez. S. tortuosum es una suculenta endémica de la región semiárida de Karroo de Sudáfrica. Una medicina tradicional de la San y Khoi Khoi gente, era utilizada para la supresión del apetito y sed, así como por sus efectos analgésicos y psicotrópicos^14,15. Actualmente, se utilizan extractos estandarizados para el tratamiento de los trastornos neuropsicológicos y neuropsiquiátricos^16,17. Los compuestos primarios de interés son el alcaloide mesembrine y sus derivados, muchos de los cuales también se encuentran en relacionados con Sceletium especies¹⁵. Poblaciones silvestres y cultivadas de S. tortuosum tienen concentraciones variables de alcaloides mesembrine, presentando así un reto de control de calidad¹⁸. Un método para la detección rápida de mesembrine alcaloides, tales como spray de hoja em, puede ser útil en el seguimiento de productos Sceletium . Ya anteriormente, no había habido ningún protocolo experimental visual detallado para el aerosol de la hoja técnica de MS, ilustramos el método utilizando el ejemplo de S. tortuosum, se describe lo siguiente: la modificación de una fuente nanospray, el selección y preparación de los tejidos de la planta, la adquisición de los datos, la interpretación de los resultados y la optimización de los parámetros de MS.

Protocol

1. modificaciones a fuente Nanospray hoja aerosol MS Use una fuente nanospray modificado para el aerosol de hoja em. Como no componentes fluídicos necesarios para pulverización foliar MS, modificar la fuente retirando la sonda de LC de la fuente. Montar el alambre de MS hoja aerosol que se aplicará la tensión en el tejido de la planta con el pasador adecuado para enchufar en la fuente. Soldar el pin a un extremo de un cable aislado; una abrazadera en el extremo opuesto del alambre de la soldadura….

Representative Results

En 10 semanas efecto invernadero aumentado después de la germinación, recién recogidos S. tortuosum deja se analizaron mediante pulverización foliar MS. El flujo de trabajo experimental para la detección de metabolitos de S. tortuosum hojas hoja aerosol que MS se ilustra en la figura 2. Una hoja fue seleccionada, cortar una tira delgada con un extremo cónico para formar un punto y afianzado con abrazadera con el aerosol de hoja em alam…

Discussion

El uso acertado de este protocolo se basa en la optimización de varios pasos de especies de plantas, tipo de tejido y establecidos de objetivo de interés. Los parámetros descritos en el protocolo proporcionan un buen punto de partida. Las siguientes decisiones experimentales tienen que ser hecho y probado: si o no al uso (1) corte o sin cortar tejido y (2) solvente o no solvente, (3) qué disolvente utilizar y en qué volumen, (4) lo que la distancia del tejido a partir de la entrada de iones debe ser y (5) la amplitu…

Materials

Conn Pin	Digi-Key elctronics	WM2563CT-ND	pin will insert into Thermo Scientific  source to provide voltage
small clamp	Digi-Key elctronics	314-1018-ND	CLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A
large clamp	Digi-Key elctronics	290-1951-ND	ALLIGATOR CLIP NARROW NICKLE 5A
Heat shrink	Digi-Key elctronics	Q2Z1-KIT-ND	to cover soldering joints
NSI source Nanospray Ion Source	Thermo scientific	NA	Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Q Exactive- hybrid quadrupole Orbitrap	Thermo scientific	NA	Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Tune Software	Thermo scientific		Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Xcalibur Software	Thermo scientific
Plant of interest – S. tortousum