Akut Ictal faaliyet kemirgen ve insan dokusu üretimi ve isteğe bağlı başlatma
Summary
Akut kriz modelleri epileptiform olaylar altında yatan mekanizmaları eğitim için önemlidir. Ayrıca, epileptiform olaylar üstünde-istek oluşturma yeteneği kendi başlatma altında yatan olay tam sırası çalışmaya son derece verimli bir yöntem sağlar. Burada, fare ve insan dokusu içinde kurulan akut 4-aminopyridine kortikal nöbet modelleri açıklar.
Abstract
Nöbetler kontrol zorlu bir sorunu için tıbbi topluluk kalır. İlerleme için araştırmacılar kapsamlı nöbeti dynamics çalışma ve onun temel mekanizmaları araştırmak için bir yol gerekir. Akut kriz modelleri uygun, elektrofizyolojik kayıtlar gerçekleştirme olanağı sunar ve electrographic nöbet benzeri (ictal) olayları çok fazla oluşturabilirsiniz. Akut kriz modelleri gelecek vaat eden bulgular sonra kronik epilepsi modelleri ve klinik deneyler için gelişmiş olabilir. Böylece, sadakatle klinik nöbet electrographic ve dinamik imzalarını taklit eden akut modelleri ele geçirme vakaları eğitim klinik bulgular yapmak için gerekli olacak. İctal olaylar insan dokudan hazırlanan akut kriz modelleri okuyan da klinik bulgular yapmak için önemlidir. Anahtar bu gazetede in vivo ve in vitro çalışmalar, hem de fare ve insan dokusu ictal olay üretme onun çok yönlülük nedeniyle kortikal 4-AP model üzerinde odaklanmıştır. Bu kağıt yöntemlerde de nöbet indüksiyon sıfır-Mg2 + modelini kullanarak alternatif bir yöntem açıklar ve avantajları ayrıntılı bir özetini ve farklı oluşturulan gibi epileptiform aktivite sınırlamaları sağlar akut nöbet modelleri. Ayrıca, piyasada bulunan optogenetic fare suşları yararlanarak, kısa (30 ms) ışık Nabzı o kendiliğinden meydana gelen benzer bir ictal olayı tetiklemek için kullanılabilir. Benzer şekilde, 30-100 ms puffs nörotransmiterler (Gamma Amino bütirik asit veya glutamat), o kendiliğinden meydana gelen aynıdır ictal olayları tetiklemek için insan dokusu uygulanabilir. Akut nöbet modellerinde isteğe bağlı ictal olayları tetiklemek için yeteneği tam sırası, nöbet başlatma dynamics altında yatan ve verimli bir şekilde değerlendirmek olası anti-nöbet tedaviler olayları gözlemlemek için newfound yeteneği sunuyor.
Introduction
Akut kriz modelleri başarıyla electrographic imza ictal olaylar electroencephalogram (EEG) kriz yaşayan bireyler gözlenen anımsatan yeniden oluşturabilirsiniz. Araştırmacılar bu ictal benzeri olaylar (burada ‘ictal olaylar’ da adlandırılır) için nöbet olay1vekilleri olarak kullanın. Klinik olarak, nöbetler beyinden kaynaklanan bir nörolojik bozukluk olduğundan ictal olaylar nöbet olaylar için güvenilir bir vekil olarak hizmet vermektedir. Epilepsi izleme birimi cinsinden nörologlar algılama beynin epileptogenic bölge onaylamak ve rezeksiyon2için yalıtmak için ictal olayların üzerine güveniyor. Yoğun bakım ünitesinde hekimler herhangi bir nöbet aktivitesi uyuşturulan hastaların3‘ te devam ederse değerlendirmek için ictal etkinliğini izleyin. Epilepsi hastalarının % 30 için kullanılabilir ilaç4,5uyuşturucu dayanıklıdır ve tıbbi durumlarda ilaçla nöbetler içeren yüzde 10’u olarak tıbbi topluluk için zorlu bir sorun olmaya nöbetler kontrol kalır Standart tedavi3yanıt vermiyor. Bu toplum için ciddi bir endişe Amerikan nüfusunun % 10 yaşamları boyunca bir nöbet olay yaşamaya aramıştı ve % 3 epilepsi6geliştirmek bekleniyor olarak sunar.
Kronik epilepsi modelleri ele geçirme vakaları Eğitim zahmetli, pahalı ve genellikle7hazırlamak aylar alır. Elektrofizyolojik kayıtlar hayvanlar özgürce hareket gerçekleştirmek zordur. İnsan klinik çalışmalarda benzer sorunları, hem de hastanın rızası, katılımcıların arka planlar ve ahlaki ve etik konuları dahil8değişkenliği ile ilgili ek karmaşıklığı yüz. Nispeten uygun hazırlamak, maliyet-etkin ve geniş hacimli çalışma9ictal olayların üretme yeteneğine sahip oldukları için akut kriz modelleri, öte yandan, uygun değildir. Ayrıca, elektrofizyolojik kayıtlar nöbeti dynamics ve ilgili temel patofizyolojisi eğitim gerekli gerçekleştirmek için ideal koşullar bu yüzden doku istikrarlı bir konumda sabit. Biyolojik malzeme beynin kurucu nöronal ağ tüm doğal faktörler ve ebatlarını değil sinaptik bağlantı ile oluşan temel çünkü akut kriz modelleri silico (bilgisayar) modelleri üzerinde olumlu kalır Hatta en ayrıntılı bilgisayar tarafından10modelleri. Bu özellikler akut kriz modelleri olası anti-nöbet tedaviler için eleme ve onları daha fazla kronik epilepsi modelleri ve klinik araştırma yapılması için ilerleyen önce ön bulgular yapma etkili olmaya hazır olun.
Genellikle, akut kriz modelleri telaşlı hiper koşullara tabi normal beyin dokusu türetilir. Sağlıklı beyin dokusu içinde klinik ictal olaylar ikna etmek için bu uyarma (E) ve (I) inhibisyon dengeli12nerede beyin en iyi şekilde kritik11 ‘ çalışmasını anlamak önemlidir. Bir bozulma e-ben denge içinde ictal olaylar çökelti telaşlı hiper nöbet durumuna neden olabilir. Buna göre bu kavramsal çerçevede Beyin dilimleri (vitro) veya bütün-beyin (in vivo) hazırlıkları ictal olayları oluşturmak için iki büyük strateji vardır: ya inhibisyon (“disinhibisyonu”) azalma ya da arttı uyarma (“Sigara-disinhibisyonu”). Ancak, ictal olaylar çok sipariş edilen ve neural ağ etkinlik13,14yönetmek için GABAergic interneurons etkisi gerektiren olaylar senkronize. Vitro bir beyin dilim gibi15, vitro disinhibisyonu modelleri genellikle aktivite spiking için yol ise bu nedenle, Sigara disinhibisyonu modelleri izole sinir ağları, üreten ictal olaylar için en etkili vardır interictal benzeri spiking anımsatan. Ayrıca, bu kavramsal çerçevede bir anlık eşitleme olayı da güvenilir bir ictal olay16tetikleyebilir. Aslında, bir ictal olay bir kritik geçiş (“çatallanma”) noktası18olduğunda sinir sistemi17 ‘ ye uygulanan herhangi bir küçük pertürbasyon tarafından tetiklenebilir. Geleneksel olarak, bu tedirginlikler elektriksel stimülasyon tarafından indüklenen. Optogenetics nörolojik, son gelişmeler ancak, şimdi kritik durumu geçişleri16ikna etmek için daha şık bir strateji sunuyor.
Bu makalede açıklanan yöntemleri ictal olayları isteğe bağlı akut kriz modelleri vitro (adım 1 Protokolü) ve in vivo çalışmalar (adım 2 iletişim kuralı) oluşturmak nasıl gösterir. Onlar beyin bölgesi, nöbet indüksiyon yöntemi, çalışma türü ve tür seçimi dahil; Ancak, odak noktası bir akut 4-AP kortikal nöbet modeli önerilen seçimi nedeniyle çok yönlü bir çeşitli çalışma türleri içinde olacaktır. Akut vitro 4-AP nöbet modeli yüksek kaliteli Beyin dilimleri elektrofizyolojik kayıtlar için hazırlamak için standart protokolü dayanmaktadır ve19görüntüleme çalışmaları. Bu protokoller zaten vitro koronal beyin dilim fareler16,20 ve insanlar21somatosensor motor korteks üzerinden yapmak için kullanılmaktadır. İctal olaylar bu tür beyin dilimler oluşturmak için değişiklikleri daha önce16 ve tüm ayrıntıları iletişim kuralı , açıklanan gösterilmiştir. Akut vivo içinde 4-AP kortikal nöbet modeli bir kranyotomi çalışmaları22görüntüleme için hazırlamak için standart protokolü dayanmaktadır. Değişiklik yok (cam slayt) pencere kranyotomi takip yüklü olduğu sunucudur. Bunun yerine, proconvulsant ajanlar (4-AP) topikal maruz korteks hayvan genel anestezi altında iken ictal olaylar ikna etmek için uygulanır. Bilgimizi, bizim grup fareler16,23bu akut vivo içinde kortikal nöbet modeli geliştirmek için ilkti. Yetişkin fareler hazırlanan akut vivo içinde 4-AP kortikal nöbet modeli Juvenil doku vitro dilim modelinden tamamlamak üzere geliştirilmiştir. Yetişkin vivo içinde nöbet modeli bulguları çoğaltma doğasında endişeleri bir 2D beyin dilim (karşı 3-b bütün-beyin fizyolojik olmayan şartlarda ilgili ele alarak dilim modelleri bulgular genelleştirmek için yardımcı olur Yapı) ve çocuk ve yetişkin doku arasındaki fizyolojik farklılıklar.
İsteğe bağlı ictal olay inisiyasyon yöntemi nörotransmitter ya puffs ile picospritzer veya optogenetic stratejileri kullanarak gösterilmiştir. Bizim bilgi en iyi şekilde, bizim grup insan dokusu nörotransmitter üzerinden bir picospritzer16kullanarak ictal olayları başlatmak için ilkidir. Optogenetic stratejileri için C57BL/6 fareler zorlanma transgenes ifade etmek için kullanılan geleneksel yük olduğunu. Channelrhodopsin-2 (ChR2) GABAergic interneurons veya glutamatergic piramit hücreleri ifade isteğe bağlı kısa ışık darbeleri ile isteğe bağlı ictal olaylar oluşturma yeteneği sağlar. ChR2 fare veziküler GABA ışınlama promotor (VGAT)24veya fare timus hücre antijen 1 kullanarak piramit hücreleri kullanarak her iki interneurons içinde ifade piyasada bulunan C57BL/6 değişken uygun optogenetic fareler suşları dahil promotor (Thy1)25. Bu piyasada bulunan VGAT-ChR2 ve Thy1-ChR2 fareler GABAergic nöronlar veya glutamatergic nöronlar, sırasıyla, mavi ile yeni korteksimiz etkinleştirmek için fırsat (470 nm) ışık. İctal olayları isteğe bağlı akut kriz modelleri oluşturma yeteneği nöbet başlatma dynamics çalışma ve verimli bir şekilde değerlendirmek olası anti-nöbet tedaviler roman fırsatlar sunabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beyin dilimleri ile proconvulsant bir ilaç ya da sinirsel ağ’ın uyarılabilirlik artışı ve bir yağış ictal Olaylar (electrographic nöbet benzeri olaylar) teşvik için değiştirilmiş bir ACSF perfusate kabul edilir. Fareler için tercih edilen koronal dilimleri motorlu somatosensor çevrenin içermelidir singulat korteks, alan 2 (CG), ama değil retrosplenial alan (RS); Bu anatomik işaretleri ictal olaylar inducing için en iyi koronal dilimleri aralığını belirlemek. İki hemisferlerin özdeş (benzer de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri (Peter L. Carlin ve Taufik A. Valiante 119603 paspas), Ontario beyin Enstitüsü (için Taufik A. Valiante) ve Mightex öğrenci araştırma bursu (için Michael Chang) tarafından desteklenmiştir. Liam uzun süre video el yazması filme onun yardım teşekkür etmek istiyorum. Şekiller ve tablolar bu el yazması içinde derleme onların yardım için Paria Baharikhoob, Abeeshan Selvabaskaran ve Shadini Dematagoda kabul etmek istiyoruz. Şekil 1A, 3A, 4Ave 6A Chang ve ark. içinde Yayınlanan verilerden yapılan tüm orijinal rakamlar 16.
Materials
| Sodium pentobarbital | N/A | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| 1 mm syringe | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| 25G 5/8” sterile needle | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Single edge razor blade (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Instant adhesive glue | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Lens paper | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Glass petri dish (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Splinter forceps (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| PVC handle micro spatula | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Micro spoon with flat end | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Detailing brush 5/0 | N/A | N/A | Purcahsed from a boutique art store |
| Wide bore transfer pipette | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Dental Tweezer | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Thermometer (digital) | N/A | N/A | Purchased on Amazon.ca |
| Check carbogen tank (95%O2/5%CO2) | N/A | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| Vibratome | Leica | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper) | Scientific Systems Design Inc | N/A | |
| Sodium Chloride (NaCl) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sodium Bicarbonate | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Dextrose | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Potassium Chloride (KCl) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Calcium Chloride (CaCl2·2H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sucrose | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
References
- Jefferys, J. G. R. Advances in understanding basic mechanisms of epilepsy and seizures. Seizure. 19 (10), 638-646 (2010).
- Fujiwara, H., et al. Resection of ictal high-frequency oscillations leads to favorable surgical outcome in pediatric epilepsy. Epilepsia. 53 (9), 1607-1617 (2012).
- Chen, H. Y., Albertson, T. E., Olson, K. R. Treatment of drug-induced seizures. British Journal of Clinical Pharmacology. 81 (3), 412-419 (2015).
- Kwan, P., Brodie, M. J. Early Identification of Refractory Epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
- Giussani, G., et al. A population-based study of active and drug-resistant epilepsies in Northern Italy. Epilepsy & Behavior. 55, 30-37 (2016).
- Pellock, J. M. Overview: definitions and classifications of seizure emergencies. Journal of Child Neurology. 22 (5_suppl), 9S-13S (2007).
- Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
- Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
- Castel-Branco, M., Alves, G., Figueiredo, I., Falcão, A., Caramona, M. The maximal electroshock seizure (MES) model in the preclinical assessment of potential new antiepileptic drugs. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 31 (2), 101-106 (2009).
- Wendling, F., Bartolomei, F., Modolo, J., Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. Neocortical/Thalamic In Silico Models of Seizures and Epilepsy. Models of Seizures and Epilepsy. , 233-246 (2017).
- Cocchi, L., Gollo, L. L., Zalesky, A., Breakspear, M. Criticality in the brain: A synthesis of neurobiology, models and cognition. Progress in Neurobiology. 158, 132-152 (2017).
- Xue, M., Atallah, B. V., Scanziani, M. Equalizing excitation-inhibition ratios across visual cortical neurons. Nature. 511 (7511), 596-600 (2014).
- Engel, J. . Seizures and epilepsy. , (2013).
- Panuccio, G., Curia, G., Colosimo, A., Cruccu, G., Avoli, M. Epileptiform synchronization in the cingulate cortex. Epilepsia. 50 (3), 521-536 (2009).
- Avoli, M., de Curtis, M. GABAergic synchronization in the limbic system and its role in the generation of epileptiform activity. Progress in Neurobiology. 95 (2), 104-132 (2011).
- Chang, M., et al. Brief activation of GABAergic interneurons initiates the transition to ictal events through post-inhibitory rebound excitation. Neurobiology of Disease. 109, 102-116 (2018).
- Jiruska, P., et al. High-frequency network activity, global increase in neuronal activity, and synchrony expansion precede epileptic seizures in vitro. The Journal of Neuroscience. 30 (16), 5690-5701 (2010).
- Jirsa, V. K., Stacey, W. C., Quilichini, P. P., Ivanov, A. I., Bernard, C. On the nature of seizure dynamics. Brain. 137 (Pt 8), 2210-2230 (2014).
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Ion Channels: Methods and Protocols. 337, 117-125 (2006).
- Li, H., Prince, D. A. Synaptic activity in chronically injured, epileptogenic sensory-motor neocortex. Journal of Neurophysiology. 88 (1), 2-12 (2002).
- Köhling, R., Avoli, M. Methodological approaches to exploring epileptic disorders in the human brain in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 1-19 (2006).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).
- Ritter, L. M., et al. WONOEP appraisal: optogenetic tools to suppress seizures and explore the mechanisms of epileptogenesis. Epilepsia. 55 (11), 1693-1702 (2014).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
- Arenkiel, B. R., et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
- Heinemann, U., Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S., et al. Brain slices from human resected tissue. Models of Seizures and Epilepsy. , 285-299 (2017).
- Florez, C., et al. In vitro recordings of human neocortical oscillations. Cerebral Cortex. 25 (3), 578-597 (2015).
- Lein, P. J., Barnhart, C. D., Pessah, I. N. Acute hippocampal slice preparation and hippocampal slice cultures. Methods in Molecular Biology. , 115-134 (2011).
- Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 1 (4), 323-325 (1979).
- Poulton, T. J., Ellingson, R. J. Seizure associated with induction of anesthesia with isoflurane. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 61 (4), 471-476 (1984).
- Borris, D. J., Bertram, E. H., Kapur, J. Ketamine controls prolonged status epilepticus. Epilepsy Research. 42 (2-3), 117-122 (2000).
- DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31 (3-5), 299-316 (2002).
- Velasco, A. L., Wilson, C. L., Babb, T. L., Engel, J. Functional and anatomic correlates of two frequently observed temporal lobe seizure-onset patterns. Neural Plasticity. 7 (1-2), 49-63 (2000).
- Vlachos, A., Reddy-Alla, S., Papadopoulos, T., Deller, T., Betz, H. Homeostatic regulation of gephyrin scaffolds and synaptic strength at mature hippocampal GABAergic postsynapses. Cerebral Cortex. 23 (11), 2700-2711 (2012).
- Kirmse, K., et al. GABA depolarizes immature neurons and inhibits network activity in the neonatal neocortex in vivo. Nature Communications. 6, 7750 (2015).
- Stein, V., Hermans-Borgmeyer, I., Jentsch, T. J., Hübner, C. A. Expression of the KCl cotransporter KCC2 parallels neuronal maturation and the emergence of low intracellular chloride. Journal of Comparative Neurology. 468 (1), 57-64 (2004).
- Wong, B. Y., Prince, D. A. The lateral spread of ictal discharges in neocortical brain slices. Epilepsy Research. 7 (1), 29-39 (1990).
- Trevelyan, A. J., Sussillo, D., Watson, B. O., Yuste, R. Modular propagation of epileptiform activity: evidence for an inhibitory veto in neocortex. Journal of Neuroscience. 26 (48), 12447-12455 (2006).
- Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1263-1270 (2000).
- MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neuroscience Letters. 303 (3), 141-144 (2001).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G., Martina, M., Taverna, S. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Patch-clamp Methods and Protocols. , 221-242 (2014).
- Swartzwelder, H. S., Lewis, D., Anderson, W., Wilson, W. Seizure-like events in brain slices: suppression by interictal activity. Brain Research. 410 (2), 362-366 (1987).
- Lees, G., Stöhr, T., Errington, A. C. Stereoselective effects of the novel anticonvulsant lacosamide against 4-AP induced epileptiform activity in rat visual cortex in vitro. Neuropharmacology. 50 (1), 98-110 (2006).
