וזמינותו שינוי טמפרטורה כדי לקבוע העדפות תרמי של הזחלים דרוזופילה
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקביעת הטמפרטורה הסביבתית המועדפת של הזחלים דרוזופילה באמצעות הדרגה תרמי רציפה.
Abstract
בעלי חיים רבים, כולל זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, מסוגלים מפלה דקה ההבדלים בטמפרטורה הסביבה, המאפשרת להם לחפש את נוף תרמי המועדפת שלהם. כדי להגדיר את העדפות טמפרטורה של הזחלים מעל טווח מוגדר ליניארי, פיתחנו וזמינותו של שימוש הדרגתי בטמפרטורה. כדי ליצור מעבר הדרגתי חד כיווני, שני רחובות אלומיניום מחובר אמבטיות מים עצמאית, שכל אחד מהם שולט הטמפרטורה של בלוקים בודדים. שני רחובות להגדיר את הגבולות העליון והתחתון של מעבר הצבע. מעבר הצבע החום היא הוקמה על ידי הצבת צלחת אלומיניום מצופה agarose מעל שני רחובות שבשליטת מים כך הצלחת משתרע על המרחק ביניהם. הקצוות של צלחת אלומיניום המוגדר על אבני מים מגדיר את טמפרטורת מינימום ומקסימום, ויוצרים האזורים שביניהם שני רחובות הדרגתי טמפרטורה לינארי. הדרגתיות וזמינותו שניתן להחיל על רימות בגילאים שונים, ניתן להשתמש כדי לזהות מוטנטים כי התערוכה הפנוטיפים, כגון אלה בעלי מוטציות המשפיעות על גנים קידוד TRP ערוצים ו opsins, אשר נדרשים עבור טמפרטורה אפליה.
Introduction
Thermotaxis הוא מועסק על ידי חיות ניידים לבחירת סביבה עם מצוינות והומלץ תנאים1,2,3. אם האקלים בצורה מוגזמת חם או קר, התנהגות זו חיונית להישרדותו. בנוסף, בעלי חיים רבים רגישים מאוד קטן הבדלי טמפרטורה בטווח נוח ונחפש את הסביבה עם טמפרטורה אידיאלית. זה חשיבות מיוחדת עבור אורגניזמים poikilothermic כמו זבובי פירות, אשר equilibrate טמפרטורת גופם עם הסביבה. מבחני לעקוב אחר thermotaxis הזחל סייעו בזיהוי, ולהבהיר את התפקידים של חיישנים מולקולריים כגון דרוזופילה ארעי קולטן פוטנציאליים (TRP) ערוצים4,5,6, rhodopsins7,8, ionotropic קולטן קולטנים (IRs)9, ואשר היצוקים החיות האלה עם רגישויות הטמפרטורה מעל טמפרטורה שונות טווחים.
בדיקת הבחירה דו כיוונית מספקת גישה אחת ללמוד העדפות תרמי ב הזחלים6,7. וזמינותו כרוך בהקמת שני אזורי טמפרטורה שונות ומאפשרת החיות לבחור צד אחד על השני. התוצאות של מבחנים דו כיוונית הבחירה יכול להיות חזקים, במיוחד אם ההבדלים בטמפרטורה בין שתי האפשרויות הן גדולות. בנוסף, מאז כל assay כרוך ליווח רק לשתי קבוצות, הנתונים ניתן לבטא מאינדקס העדפה פשוטה. הקלות והפשטות של מבחני בחירה דו-כיווני נתונות גם למסכים גנטי. אולם, מגבלה עיקרית היא כי ניסויים רבים נדרשים לקבוע את הטמפרטורה המועדף של חיות פראי-סוג או מוטציה.
Assay הדרגתיות מציעה הזדמנות להקים את הטמפרטורה המועדף assay יחידה8. יתר על כן, בניגוד הבדיקה הבחירה דו-כיווני, הוא מאפשר את ההערכה של ההתפלגות של קבוצה של בעלי חיים, כאשר התעמת עם טווח רציף של טמפרטורות. Assay מעבר צבע אחד משתמש צלחת פטרי וחיות יחיד והוא מתאים היטב אפיון ההתנהגות מפורט של חיות בודדות10. אולם, מאז פטרי עגול, הגודל של אזורי טמפרטורה משתנים, קטנים בהדרגה בהתאם למרחק מן המרכז. לכן, תוכנית התקנה זו אינה אידיאלית לניטור הבחירות טמפרטורה של אוכלוסיות בעלי חיים.
מנגנון הדרגתיות תרמי רציפה, כי הוא מתאים היטב כדי להעריך את העדפות טמפרטורה של קבוצות של הזחלים מעסיקה של ארנה מלבני, מתואר כאן. המנגנון הוא פשוט לבנות ולהרכיב. בנוסף, מעבר הצבע הוא ליניארי, הוא גמיש, כמו זה יכול לשמש כדי להעריך את thermotaxis מעל טמפרטורה גדול נע בין 10 ° C ל 42 º C. וזמינותו היא מהירה וישירה לביצוע ותשואות לשחזור נתונים. בנוסף דיווח הטמפרטורה המועדף של הזחלים, היא מגלה את ההעדפות של אוכלוסיית חיות מעל וההתדיינות ליניארי בניסוי יחיד. בשל יתרונות אלו, זה הוא בחירה מצוינת עבור זיהוי גנים הדרושים עבור thermotaxis.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי להבטיח את ההצלחה של פרוטוקול זה, חשוב לנקוט צעדים כדי להשיג נאותה מספרים של הזחלים לביצוע הניסויים. אלה כוללים מראש האכלה של זבובים בקבוקונים המכילים הדבק שמרים במשך 2-3 d כדי לשפר את הנחת הביצה. הבקבוקונים צריך להיות מניחים במגש המכיל מים בקבוקונים בתוך שקית פלסטיק שקוף, אשר שומרת על הל?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.M. נתמך על ידי מימון NEI (EY008117, EY010852), NIDCD (DC007864, DC016278), של NIAID (1DP1AI124453).
Materials
| Gradient assay apparatus | |||
| PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath | Thomas Scientific | 9106 | This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz. |
| Aluminum assay plate (for single directional gradient) | Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized. | ||
| Aluminum plate (for bidirectional gradient) | 25 x 22 x 0.2 cm, black anodized. | ||
| Aluminum block | Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D. | ||
| Connector for aluminum blocks and tubing | McMaster-Carr | 91355K82 | |
| Tygon Sanitary Silicone Tubing | Tygon | 57296 | 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Items and reagents for assay | |||
| Pestle | USA Scientific | 17361 | Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes |
| Thermometer | Fluke | 51II | |
| Thermocouple | Fluke | K type | |
| Universal microplate lid | Corning | 6980A77 | |
| 35 mm dish | Corning | 9380D40 | |
| Labeling tape (for bidirectional gradient) | Fisher Scientific | 15-951 | Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | Prepare 1% solution |
| Sucrose | Sigma | S0389-5KG | Prepare 18% solution right before starting assay |
| Paint brush | Fisher Scientific | 11860 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Denville | C1062-P | |
| Scoopula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| 500 mL round wide-mouth bottle | Pyrex | 1395-500 | |
| Cell strainer (300 mm pore) | PluriSelect | 43-50300 | Optional item for larvae washing |
| Cardboard box (vial tray) | Genesee Scientific | FS32-124 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila food | |||
| Distilled water | 22,400 mL | ||
| Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg | LabScientific Inc. | NC0535320 | 1,609 g |
| Brewers yeast 100 lbs | MP Biomedicals | ICN90331280 | 379 g |
| NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit) | Genesee Scientific | 62-115 | 221 g |
| Drosophila Agar, Type II (5 kg) | Genesee Scientific | 66-103 | 190 g |
| Karo light corn syrup | Karo | 1,700 mL | |
| Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol) | Sigma Aldrich | H5501-5KG | 72 g/240 mL |
| Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC) | Sigma Aldrich | 81910-1 L | 108 mL |
| Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O | Sigma Aldrich | 438081-500 mL | 8.5 mL |
References
- Fowler, M. A., Montell, C. Drosophila TRP channels and animal behavior. Life Sci. 92, 394-403 (2013).
- Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals. Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).
- Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. Peripheral thermosensation in mammals. Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).
- Rosenzweig, M., et al. The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis. Genes Dev. 19, 419-424 (2005).
- Kwon, Y., Shim, H. S., Wang, X., Montell, C. Control of thermotactic behavior via coupling of a TRP channel to a phospholipase C signaling cascade. Nat Neurosci. 11, 871-873 (2008).
- Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons. J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).
- Shen, W. L., et al. Function of rhodopsin in temperature discrimination in Drosophila. Science. 331 (6022), 1333-1336 (2011).
- Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins. Cell Rep. 17, 336-344 (2016).
- Ni, L., et al. The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Luo, L., et al. Navigational decision making in Drosophila thermotaxis. J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: a laboratory handbook. , (2005).
