Microscopie spectrale réflectométrique sur les axones myélinisés In Situ

Résumé

Nous présentons ici un protocole étape par étape pour l’imagerie des axones myélinisés dans une tranche de cerveau fixe à l’aide d’une échelle nanométrique exempte d’étiquette d’imagerie technique basée sur la réflectométrie spectrale.

Résumé

Dans un système nerveux des mammifères, la myéline fournit une isolation électrique par Envellopants les fibres axonales dans une spirale de multicouche. Inspiré par son architecture sous-cellulaire très organisés, nous avons récemment développé une nouvelle modalité d’imagerie, nommée réflectométrie spectrale (diffuseurs), qui permet l’imagerie nanométriques de label-free sans précédent de l' axones myélinisés live in situ. Le principe sous-jacent est d’obtenir des informations de la nanostructure en analysant le spectre de réflectance de la structure multicouche subcellulaire. Dans cet article, nous décrivons un protocole détaillé étape par étape pour réaliser une imagerie de diffuseurs de base des tissus nerveux à l’aide d’un système microscopique confocal commercial, équipé d’un laser de lumière blanche et d’un filtre accordable. Nous couvrons les procédures de préparation des échantillons, acquisition de données spectrales et traitement d’image pour obtenir des informations de nanostructure.

Introduction

Dans le système nerveux des mammifères, la myéline fournit la conduction nerveuse rapide et intégrité axonale par Envellopants les fibres axonales avec gaines membraneuses multicouches. Sa structure multicouche est composé d’une alternance de minces nanométriques composées de membranes plasmiques (~ 5 nm), cytosol (environ 3 nm) et les espaces extracellulaires (~ 7 nm)^1,2. La microscopie optique, y compris la microscopie de Super-résolution récente, ne conviennent pas pour l’observation de la dynamique de la myéline échelle nanométrique en raison de leur résolution insuffisante en raison de la diffraction opti....

Protocole

Toutes les interventions chirurgicales ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université Sungkyunkwan.

1. préparation de l’échantillon

Remarque : Stériliser tous les instruments chirurgicaux avant toute manipulation animale. Effectuer toutes les performances chirurgicales dans une salle dédiée aux interventions chirurgicales. Gants et blouses stériles doivent être portées par tout le personnel dans la salle de chirurgie en permanence.

1. Fixation du tissu
   1. Préparer les deux seringues de 10 mL que chacun rempli de solution saline tampo....

Résultats

Selon le protocole, une tranche fixe de cerveau a été préparée avec la coloration exogène, un fluorophore de ciblage de la myéline (voir Table des matières). Diffuseurs imagerie a été réalisée sur la tranche du cerveau en utilisant un microscope confocal hyperspectral commercial conjointement avec confocal fluorescence imaging (Figure 4 a). Pour diffuseurs, intensité optique d’entrée a été fixée à 5 µW/µm² avec un temps de pause de.......

Discussion

Diffuseurs est une nouvelle modalité d’imagerie exempte d’étiquette basée sur l’interférométrie spectrale, qui pour la première fois, offre l’information de l’échelle nanométrique dans les axones myélinisés direct. Dans le protocole actuel de l’acquisition, la résolution spatiale pour le diamètre de l’axone est de l’ordre de 10 nm. En outre, diffuseurs utilise des ordres de grandeur plus faible dose légère par rapport aux autres microscopies de Super-résolution ; Il est donc exempt de photoblanchiment et de phototoxicité.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Coupe-verre	-		Peut être acheté dans un dépanneur local ou dans des magasins en ligne.
Vernis à ongles	-		Peut être acheté dans un dépanneur local ou dans des magasins en ligne.
Objectif apochromatique 40°, NA 1.1	Leica Microsystems	15506357	Type à immersion
dans l’eau Fluoromyéline Vert	Thermo Fisher	F34651	Alternativement, le Rouge Fluoromyéline (F34652) peut être utilisé.
Microscope Leica SP8 TCS	Leica Microsystems	SP8	Pour plus de détails, reportez-vous à la section « Configuration du microscope » dans la section Introduction.
Logiciel d’imagerie	Leica Microsystems	LAS-X-Matlab
	MathWorks	-	-
Mirror	Thorlabs	PF10-03-P01	Recouvert d’argent protégé.
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Life technologies	14190-136-Paraformaldéhyde
	Biosolution	BP031a	4 % v/v dans PBS
Lame de recouvrement	Thermo Fisher	3306	Epaisseur : #1 (0,13 à 0,17 mm)
Verre lame	Muto Pure Chemicals	5116-20F	Épaisseur : ~1 mm
Super colle	Henkel	Loctite 406	Utilisez un équipement de distribution pour éviter tout contact avec la peau ou les yeux.
Pousse-seringue	Brainetree Scientific		BS-8000 DUAL-Vibratome
	Leica Biosystems	VT1200S-Laser
à lumière blanche	NKT photonique	EXB-6	EXB-6 a été abandonné et remplacé par EXU-6.