Laktat Dehydrogenase Sequestration Assay — En simpel og pålidelig metode til at bestemme Bulk Autophagic beslaglæggelse aktivitet i pattedyrceller
Summary
Her beskrives et simpelt og godt valideret protokol til måling af bulk autophagic beslaglæggelse aktivitet i pattedyrsceller. Metoden er baseret på kvantificere andelen af laktat dehydrogenase (LDH) i sedimentable celle fraktioner i forhold til samlede cellulære LDH niveauer.
Abstract
Bulk autophagy er karakteriseret ved binding af store dele af cytoplasma i dobbelt/multi-membrane strukturer kaldes autophagosomes. Her beskrives en simpel protokol til at overvåge denne proces. Desuden tilbydes typiske resultater og eksperimenterende validering af metoden på autophagy-inducerende betingelser i forskellige typer af kulturperler pattedyrsceller. Under bulk autophagy udskille autophagosomes cytosol, og dermed også opløselige cytosole proteiner, sammen med andre autophagic last. LDH er en stabil og meget rigelige, opløselige cytosole enzym, der er ikke selektivt afsondret i autophagosomes. Mængden af LDH sequestration derfor afspejler mængden af bulk autophagic binding. For at bestemme LDH binding i celler, effektivt og præcist, ansætter vi en electrodisruption-baseret fraktionering protokol, der effektivt adskiller sedimentable fra cytosole LDH, efterfulgt af måling af enzymatisk aktivitet i sedimentable brøker versus hele-celle prøver. Autophagic binding bestemmes ved at fratrække del af sedimentable LDH i ubehandlet celler fra at i behandlede celler. Fordelen ved LDH sequestration assay er at det giver en kvantitativ måling af den autophagic binding af endogene last, i modsætning til andre metoder, enten indebærer Ektopisk udtryk for binding sonder eller semi-kvantitative protease beskyttelse analyser af autophagy markører eller receptorer.
Introduction
Autophagy (græsk for “selv spise”) er en evolutionær bevarede proces for vakuolære/lysosomale nedbrydning af intracellulære materiale. Efter opdagelsen af autophagy-relaterede (“ATG”) gener, som er vigtige for autophagy gær og mennesker, og erkendelsen af at autophagy spiller en væsentlig rolle i menneskers sundhed og sygdom (anerkendt af Nobelprisen i medicin eller fysiologi til i 2016 Yoshinori Ohsumi), autophagy er hurtigt blevet en af de mest intenst undersøgt processer i celle biologi1,2.
Macroautophagy (i det følgende benævnt “autophagy”) er præget af ekspansion og foldning af intracellulære membran cisternae (“phagophores”) i hermetisk lukkede og dobbelt eller multi membrane strukturer (“autophagosomes”), der effektivt udskille den enwrapped materiale fra resten af cytoplasma. Ved fusion af autophagosomes med lysosomer, er indre autophagosomal membran og afsondret lasten nedbrudt og genanvendt. Autophagosomes kan udskille cytoplasmatisk materiale i både tilfældige (non-selektive autophagy) og selektiv (selektiv autophagy) manerer. Bulk autophagy sandsynligvis repræsenterer en blanding af non-selektive og selektive autophagy.
I 1960-erne og 70 ‘s (“morfologiske æra” autophagy forskning), blev autophagic binding primært vurderet gennem ultrastrukturelle analyser. I 1980-erne og begyndelsen af 1990 (“den biokemiske æra”) pr. Seglen og kollegaer – der studerede autophagy i primære rotte hepatocytter — udviklet de første metoder til at måle kvantitativt autophagic beslaglæggelse aktivitet3. Bruger disse assays, Seglen defineret og karakteriseret forskellige trin af autophagic-lysosomale vejen4,5, opdaget, opfundet amphisome6 (product af endosome-autophagosome fusion) og var først til at beskrive rollen af protein fosforylering i autophagy regel7. Men efter opdagelsen af ATGs i 1990erne (“den molekylære æra”) og den første karakterisering af et protein af pattedyr ATG8, mikrotubulus-forbundet protein 1A/1B-lys kæde 3 (LC3) i 20008, brug af ATG proteiner som markører for den autophagic proces hurtigt vundet popularitet, og de ældre og mere besværlig biokemiske metoder blev efterladt. I virkeligheden, i de sidste 18 år, vestlige skamplet og Fluorescens mikroskopi analyser af LC3 er blevet den langt mest populære (og i mange tilfælde den eneste) måde at studere autophagy i pattedyrceller. Fordelen er den relative lethed, hvormed disse metoder kan gennemføres. Ulempen er, at man studerer en vogn komponent (LC3) i stedet for faktiske autophagic last. Dette er en temmelig alvorlig ulempe, fordi forholdet mellem de stater og/eller flux af LC3 gennem vej versus binding og flux af lasten er meget uklart. Faktisk har vi vist, bulk last flux kan bevares på et højt niveau under forhold hvor der ikke er nogen LC3 flux, trods tilstedeværelsen af konjugeret LC3 i celler9. Vi viste desuden, at bulk autophagy er upåvirket af effektiv LC3 udtynding, og sandsynligvis er således LC3-uafhængig9. Denne konstatering er senere blevet bekræftet af LC3 knock-out undersøgelser10,11, som også viser, Parkin-afhængige mitophagy (den selektive autophagy af mitochondrier) er uafhængig af LC310,11 .
I sammendrag, der er et klart behov for fragt-baserede assays til at overvåge autophagic aktivitet. Optimalt bør sådanne assays være bredt gældende, velafgrænset og let at udføre. I de sidste par år har vi taget en særlig interesse i LDH sequestration assay, som blev udviklet af Per Seglen i 1980 ‘s12, og er baseret på måling af overførsel af cytosole LDH til sedimentable, autophagic vakuole-holdige celle fraktioner. LDH er en stabil, opløselige cytosole protein, der er let Co afsondret når phagophores enwrap cytoplasmatisk last. Binding af LDH er derfor en generel foranstaltning af autophagic binding. LDH er udelukkende nedbrudt af autophagic-lysosomale vej12. Således, i overværelse af lysosomale nedbrydning hæmmere, fx, bafilomycin A1 (Baf)13, eksperimentel behandling effekter direkte afspejler ændringer i autophagic forvaring aktivitet. I mangel af nedbrydning hæmmere, kan nettoeffekten af ændringer i LDH binding og nedbrydning måles.
LDH sequestration assay er generelt gældende, da LDH er stærkt og allestedsnærværende udtrykt i alle celletyper, og LDH niveauer kan kvantificeres præcist ved en enzymatisk assay14,15. Men oprindelige protokol12 — etableret i primære rotte hepatocytter — var temmelig tidskrævende og krævede en stor mængde af starter materiale samt en custom-made elektrisk udladning kondensator. I en trinvis måde, har vi gradvist omdannet analysen til en nem og alsidig metode. Først, den originale protokol blev tilpasset til brug i pattedyr celle linjer16. For det andet var metoden væsentligt nedskaleret3,9. Tredje, flere trin i protokollen blev elimineret, herunder en møjsommelig tæthed pude trin17. Dette aktiveret samtidigt en yderligere nedskalering af metoden, fra det oprindelige startpunkt for at bruge en 10 cm plade pr. sample16 til ved hjælp af et enkelt godt fra en 12-godt plade pr. sample (dvs.ca 15-fold mindre starter materiale)17. For det fjerde, vi identificeret en kommerciel elektroporation apparat, der kunne erstatte de skræddersyede elektriske udladning kondensator17.
Her præsenteres vores nyeste protokol af LDH sequestration assay, som omfatter nogle yderligere forenklinger af metoden i forhold til den tidligere udgivne17 . Desuden et sæt af typiske resultater opnået i en række forskellige celletyper er vist, og vigtigere, flere linjer af eksperimentelle valideringer af metoden ved hjælp af farmakologiske samt genetiske knockdown og knockout tilgange leveres. For en overordnet flow ordning af den hele protokol, se figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sammenfattende repræsenterer protokol beskrevet her en pålidelig og bredt anvendelig metode til at overvåge bulk autophagic beslaglæggelse aktivitet i pattedyrsceller. I forhold til den oprindelige metode12,16, har vi fjernet en række unødvendige skridt, forenklet flere af de resterende trin og indført en betydelig nedtrapning. Som et resultat af protokollen er væsentligt forbedret i forhold til pris – og tid-effektivitet, og det samme antal prøver kan n…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev økonomisk støttet af Norges forskning Rådet, universitetet i Oslo, Anders Jahre Foundation, Nansen Foundation og arv i mindet om Henrik Homan. Vi takker Dr. Noboru Mizushima for ATG5 +/ + MEFs og ATG5-/-MEFs, Dr. Masaaki Komatsu for ATG7 +/ + MEFs og ATG7/MEFs, og Dr. Shizuo Akira for ATG9A +/ + MEFs og ATG9A/MEFs. Vi takker Frank Sætre for teknisk bistand, og Dr. Per O. Seglen for konstruktiv metodologiske diskussioner.
Materials
| 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 211-2130 and 211-2120 | |
| 12-well plates | Falcon | 353043 | |
| Accumax cell detachment solution | Innovative Cell Technologies | A7089 | Keep aliquots at -20 °C for years, and in fridge for a few months |
| Bafilomycin A1 | Enzo | BML-CM110-0100 | Dissolve in DMSO |
| BJ cells | ATCC | CRL-2522 | use at passage <30 |
| Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 422361V | |
| Burker counting chamber | Fisher Scientific | 139-658585 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientfic | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientfic | AMQAX1000 | |
| Cover glass for the Burker counting chamber | Fisher Scientific | 139-658586 | |
| Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26-well, 15 µl, 13.3 x 8.7 cm (W x L) | Bio-Rad | 3450034 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Earle's balanced salt solution (EBSS) | Gibco | 24010-043 | conatains 0.1% glucose |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Electroporation cuvette (4 mm) | Bio-Rad | 1652088 | |
| Exponential decay wave electroporator | BTX Harvard Apparatus | EMC 630 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | 10% final concentration in RPMI 1640 medium |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750 | Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months |
| Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator | NuAire | NU-5510E | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher | 13778150 | |
| LNCaP cells | ATCC | CRL-1740 | use at passage <30 |
| 3-Methyl Adenine (3MA) | Sigma-Aldrich | M9281 | Stock 100 mM in RPMI in -20 °C. Heat stock to 65 °C for 10 minutes, and use at 10 mM final concentration |
| Refridgerated Microcentrifuge | Beckman Coulter Life Sciences | 368831 | |
| Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function | Eppendorf | Eppendorf 5417R | |
| MRT67307 hydrochloride (ULKi) | Sigma-Aldrich | SML0702 | Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO. |
| MaxMat Multianalyzer instrument | Erba Diagnostics | PL-II | |
| MCF7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| NADH | Merck-Millipore | 1.24644.001 | |
| Nycodenz | Axis-Shield | 1002424 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher | 31985062 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012-019 | |
| Pipette tips 3 (0.5-20 µl) | VWR | 732-2223 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipette tips (1-200 µl) | VWR | 732-2207 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipette tips (100-1000µl) | VWR | 732-2355 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipettes | ThermoFisher | 4701070 | Finnpipette F2 GLP Kit |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407-10X5MG | Make a 1 mg/ml stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 °C for at least 1 year. |
| Pyruvate | Merck-Millipore | 1066190050 | |
| RPE-1 cells (hTERT RPE-1) | ATCC | CRL-4000 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-037 | |
| SAR-405 | ApexBio | A8883 | Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO. |
| Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl) | ThermoFisher/Ambion | 4390843 | |
| Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A) | ThermoFisher/Ambion | s35504 | |
| Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200) | ThermoFisher/Ambion | s18995 | |
| Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1) | ThermoFisher/Ambion | s15964 | |
| Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2) | ThermoFisher/Ambion | s18705 | |
| Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP) | ThermoFisher/Ambion | s22362 | |
| Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1) | ThermoFisher/Ambion | s24333 | |
| Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2) | ThermoFisher/Ambion | s22387 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 • 2H2O) | Merck-Millipore | 1.06580.1000 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 • 2H2O ) | Prolabo | 28014.291 | |
| Sucrose | VWR | 443816T | 10% final concentration in water; filter through 0.45 µm filter and keep in fridge for months |
| Thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO. |
| Triton X-405 | Sigma-Aldrich | X405 | 1% final |
| Trypan Blue stain 0.4% | Molecular Probes | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin) | Gibco | 25200-056 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | 0.01% final |
References
- Rubinsztein, D. C., Frake, R. A. Yoshinori Ohsumi’s Nobel Prize for mechanisms of autophagy: from basic yeast biology to therapeutic potential. J R Coll Physicians Edinb. 46 (4), 228-233 (2016).
- Mizushima, N. The exponential growth of autophagy-related research: from the humble yeast to the Nobel Prize. FEBS Lett. 591 (5), 681-689 (2017).
- Seglen, P. O., et al. Macroautophagic cargo sequestration assays. Methods. 75, 25-36 (2015).
- Hoyvik, H., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Use of a hydrolysable probe, [14C]lactose, to distinguish between pre-lysosomal and lysosomal steps in the autophagic pathway. Exp Cell Res. 166 (1), 1-14 (1986).
- Plomp, P. J., Gordon, P. B., Meijer, A. J., Hoyvik, H., Seglen, P. O. Energy dependence of different steps in the autophagic-lysosomal pathway. J Biol Chem. 264 (12), 6699-6704 (1989).
- Gordon, P. B., Seglen, P. O. Prelysosomal convergence of autophagic and endocytic pathways. Biochem Biophys Res Commun. 151 (1), 40-47 (1988).
- Holen, I., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Protein kinase-dependent effects of okadaic acid on hepatocytic autophagy and cytoskeletal integrity. Biochem J. 284, 633-636 (1992).
- Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. Embo j. 19 (21), 5720-5728 (2000).
- Szalai, P., et al. Autophagic bulk sequestration of cytosolic cargo is independent of LC3, but requires GABARAPs. Exp Cell Res. 333 (1), 21-38 (2015).
- Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. J Cell Biol. , (2016).
- Pontano Vaites, L., Paulo, J. A., Huttlin, E. L., Harper, J. W. Systematic analysis of human cells lacking ATG8 proteins uncovers roles for GABARAPs and the CCZ1/MON1 regulator C18orf8/RMC1 in macro and selective autophagic flux. Mol Cell Biol. , (2017).
- Kopitz, J., Kisen, G. O., Gordon, P. B., Bohley, P., Seglen, P. O. Nonselective autophagy of cytosolic enzymes by isolated rat hepatocytes. J Cell Biol. 111 (3), 941-953 (1990).
- Bowman, E. J., Siebers, A., Altendorf, K. Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (21), 7972-7976 (1988).
- Hadjivassiliou, A. G., Rieder, S. V. The enzymatic assay of pyruvic and lactic acids. A definitive procedure. Clin Chim Acta. 19 (3), 357-361 (1968).
- Bergmeyer, H. U., Bernt, E., Bergmeyer, H. U. . Methods of enzymatic analysis (2nd English ed). 2, 574-579 (1974).
- Engedal, N., et al. Modulation of intracellular calcium homeostasis blocks autophagosome formation. Autophagy. 9 (10), 1475-1490 (2013).
- Luhr, M., et al. A Simple Cargo Sequestration Assay for Quantitative Measurement of Nonselective Autophagy in Cultured Cells. Methods Enzymol. 587, 351-364 (2017).
- Mousavi, S. A., et al. Effects of inhibitors of the vacuolar proton pump on hepatic heterophagy and autophagy. Biochim Biophys Acta. 1510 (1-2), 243-257 (2001).
- Seglen, P. O., Gordon, P. B. 3-Methyladenine: specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (6), 1889-1892 (1982).
- Ronan, B., et al. A highly potent and selective Vps34 inhibitor alters vesicle trafficking and autophagy. Nat Chem Biol. 10 (12), 1013-1019 (2014).
- Saetre, F., Hagen, L. K., Engedal, N., Seglen, P. O. Novel steps in the autophagic-lysosomal pathway. Febs j. 282 (11), 2202-2214 (2015).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
- Seglen, P. O., Overbye, A., Saetre, F. Sequestration assays for mammalian autophagy. Methods Enzymol. 452, 63-83 (2009).
- Hurley, J. H., Young, L. N. Mechanisms of Autophagy Initiation. Annu Rev Biochem. 86, 225-244 (2017).
- Thastrup, O., Cullen, P. J., Drobak, B. K., Hanley, M. R., Dawson, A. P. Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca2+ stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum Ca2(+)-ATPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (7), 2466-2470 (1990).
- Kuma, A., et al. The role of autophagy during the early neonatal starvation period. Nature. 432 (7020), 1032-1036 (2004).
- Komatsu, M., et al. Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice. J Cell Biol. 169 (3), 425-434 (2005).
- Saitoh, T., et al. Atg9a controls dsDNA-driven dynamic translocation of STING and the innate immune response. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20842-20846 (2009).
- Gordon, P. B., Seglen, P. O. Autophagic sequestration of [14C]sucrose, introduced into rat hepatocytes by reversible electro-permeabilization. Exp Cell Res. 142 (1), 1-14 (1982).
- An, H., Harper, J. W. Systematic analysis of ribophagy in human cells reveals bystander flux during selective autophagy. Nat Cell Biol. 20 (2), 135-143 (2018).
- Fass, E., Shvets, E., Degani, I., Hirschberg, K., Elazar, Z. Microtubules support production of starvation-induced autophagosomes but not their targeting and fusion with lysosomes. J Biol Chem. 281 (47), 36303-36316 (2006).
- Velikkakath, A. K., Nishimura, T., Oita, E., Ishihara, N., Mizushima, N. Mammalian Atg2 proteins are essential for autophagosome formation and important for regulation of size and distribution of lipid droplets. Mol Biol Cell. 23 (5), 896-909 (2012).
- Øverbye, A., Sætre, F., Hagen, L. K., Johansen, H. T., Seglen, P. O. Autophagic activity measured in whole rat hepatocytes as the accumulation of a novel BHMT fragment (p10), generated in amphisomes by the asparaginyl proteinase, legumain. Autophagy. 7 (9), 1011-1027 (2011).
- Kominami, E., Hashida, S., Khairallah, E. A., Katunuma, N. Sequestration of cytoplasmic enzymes in an autophagic vacuole-lysosomal system induced by injection of leupeptin. J Biol Chem. 258 (10), 6093-6100 (1983).
- Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Ogier-Denis, E., et al. A heterotrimeric Gi3-protein controls autophagic sequestration in the human colon cancer cell line HT-29. J Biol Chem. 270 (1), 13-16 (1995).
- Seglen, P. O., Gordon, P. B., Tolleshaug, H., Hoyvik, H. Use of [3H]raffinose as a specific probe of autophagic sequestration. Exp Cell Res. 162 (1), 273-277 (1986).
- Luhr, M., Sætre, F., Engedal, N. The Long-lived Protein Degradation Assay: an Efficient Method for Quantitative Determination of the Autophagic Flux of Endogenous Proteins in Adherent Cell Lines. Bio-protocol. 8 (9), e2836 (2018).
- Ronning, O. W., Pettersen, E. O., Seglen, P. O. Protein synthesis and protein degradation through the cell cycle of human NHIK 3025 cells in vitro. Exp Cell Res. 123 (1), 63-72 (1979).
- Seglen, P. O., Grinde, B., Solheim, A. E. Inhibition of the lysosomal pathway of protein degradation in isolated rat hepatocytes by ammonia, methylamine, chloroquine and leupeptin. Eur J Biochem. 95 (2), 215-225 (1979).
- Seglen, P. O., Solheim, A. E. Valine uptake and incorporation into protein in isolated rat hepatocytes. Nature of the precursor pool for protein synthesis. Eur J Biochem. 85 (1), 15-25 (1978).
- Bauvy, C., Meijer, A. J., Codogno, P. Assaying of autophagic protein degradation. Methods Enzymol. 452, 47-61 (2009).
- Engedal, N., Seglen, P. O. Autophagy of cytoplasmic bulk cargo does not require LC3. Autophagy. 12 (2), 1-3 (2016).
