स्तनपान डिहाइड्रोजनेज ज़ब्ती परख-एक सरल और विश्वसनीय विधि स्तनधारी कोशिकाओं में थोक Autophagic ज़ब्ती गतिविधि निर्धारित करने के लिए
Summary
यहां स्तनधारी कोशिकाओं में थोक autophagic ज़ब्ती गतिविधि को मापने के लिए एक सरल और अच्छी तरह से मांय प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है । विधि कुल सेलुलर LDH स्तर की तुलना में अवसादी कोशिका अंशों में स्तनपान डिहाइड्रोजनेज (LDH) के अनुपात को बढ़ाता है पर आधारित है ।
Abstract
थोक autophagy डबल में कोशिका द्रव्य के बड़े हिस्से की ज़ब्ती की विशेषता है/बहु झिल्ली संरचनाओं autophagosomes का कार्यकाल । यहां एक सरल प्रोटोकॉल इस प्रक्रिया की निगरानी के लिए वर्णित है । इसके अलावा, विशिष्ट परिणाम और संस्कृति स्तनधारी कोशिकाओं के विभिंन प्रकार में autophagy उत्प्रेरण शर्तों के तहत विधि के प्रयोगात्मक सत्यापन प्रदान की जाती हैं । के दौरान थोक autophagy, autophagosomes एकांत cytosol, और इस तरह भी घुलनशील cytosolic प्रोटीन, अन्य autophagic कार्गो के साथ. LDH एक स्थिर और अत्यधिक प्रचुर मात्रा में घुलनशील cytosolic एंजाइम है कि गैर-चुनिंदा autophagosomes में तनहा है । LDH ज़ब्त की रकम इसलिए थोक autophagic ज़ब्त की मात्रा को दर्शाती है. कुशलता और सही कोशिकाओं में LDH ज़ब्ती का निर्धारण करने के लिए, हम प्रभावी ढंग से cytosolic LDH से तलछट अलग करता है कि एक electrodisruption आधारित अंश प्रोटोकॉल, अवसाद में एंजाइमी गतिविधि की माप के बाद काम पूरे सेल नमूने बनाम भिन्न । Autophagic ज़ब्ती इलाज कोशिकाओं में उस से अनुपचारित कोशिकाओं में अवसादपूर्ण LDH के अनुपात को घटाकर द्वारा निर्धारित किया जाता है. LDH ज़ब्ती परख का लाभ यह है कि यह अंतर्जात कार्गो के autophagic ज़ब्ती का एक मात्रात्मक उपाय देता है, के रूप में अंय तरीकों कि या तो ज़ब्ती जांच या अर्द्ध मात्रात्मक के अस्थानिक अभिव्यक्ति शामिल करने का विरोध autophagy मार्करों या रिसेप्टर्स के संरक्षण विश्लेषण.
Introduction
Autophagy (“स्वयं के लिए यूनानी-खा”) एक विकासवादी vacuolar/lysosomal intracellular सामग्री के क्षरण के लिए प्रक्रिया को संरक्षित है । autophagy की खोज पर संबंधित (“ATG”) जीन है, जो खमीर और मनुष्यों में autophagy के लिए महत्वपूर्ण हैं, और बोध है कि autophagy मानव स्वास्थ्य और रोग में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है (२०१६ चिकित्सा या फिजियोलॉजी में नोबेल पुरस्कार से स्वीकार किया Yoshinori Ohsumi), autophagy जल्दी से एक सेल जीवविज्ञान1,2में सबसे अधिक तीव्रता से अध्ययन प्रक्रियाओं में से एक बन गया है ।
Macroautophagy (इसके बाद “autophagy” के रूप में संदर्भित) विस्तार और intracellular झिल्ली cisternae की तह की विशेषता है (“phagophores”) में सील, डबल या बहु झिल्ली संरचनाओं (“autophagosomes”) है कि प्रभावी ढंग से एकांत बाकी कोशिका द्रव्य से enwrapped सामग्री । lysosomes के साथ autophagosomes के संलयन पर, भीतरी autophagosomal झिल्ली और तनहा कार्गो नीचा और पुनर्नवीनीकरण है । Autophagosomes दोनों रैंडम (गैर चुनिंदा autophagy) और चयनात्मक (चयनात्मक autophagy) शिष्टाचार में cytoplasmic सामग्री एकांत कर सकते हैं । बल्क autophagy सबसे अधिक संभावना गैर-चयनात्मक और चुनिंदा autophagy के मिश्रण का प्रतिनिधित्व करता है ।
में 1960 है और 70 है (“autophagy अनुसंधान के रूपात्मक युग”), autophagic ज़ब्ती मुख्य रूप से ultrastructural विश्लेषण के माध्यम से मूल्यांकन किया गया । में 1980 है और 1990 की शुरुआत (“जैव रासायनिक युग”) Seglen और सह के प्रति कार्यकर्ता-जो प्राथमिक चूहे हेपैटोसाइट्स में autophagy का अध्ययन-पहले तरीकों को मात्रात्मक autophagic ज़ब्ती गतिविधि3मापने के लिए विकसित की है । इन परख, Seglen परिभाषित और autophagic के विभिंन कदम-lysosomal मार्ग4,5विशेषता का उपयोग कर, की खोज की और amphisome6 गढ़ा (endosome-autophagosome संलयन के उत्पाद), और पहले था autophagy रेगुलेशन७में प्रोटीन फास्फारिलीकरण की भूमिका का वर्णन कीजिये. हालांकि, 1990 में ATGs की खोज के बाद (“आणविक युग”) और एक स्तनधारी ATG8 प्रोटीन के पहले लक्षण वर्णन, microtubule-जुड़े प्रोटीन 1a/1b-लाइट चेन 3 (LC3) में २०००8, के लिए मार्करों के रूप में ATG प्रोटीन का उपयोग autophagic प्रक्रिया जल्दी लोकप्रियता प्राप्त की है, और पुराने और अधिक श्रमसाध्य जैव रासायनिक तरीकों को पीछे छोड़ दिया गया । वास्तव में, पिछले 18 वर्षों में, पश्चिमी दाग और LC3 के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विश्लेषण से अब तक के सबसे लोकप्रिय बन गए है (और कई मामलों में ही) स्तनधारी कोशिकाओं में autophagy अध्ययन का मतलब है । लाभ रिश्तेदार आसानी है जिसके द्वारा इन तरीकों से बाहर किया जा सकता है । नुकसान यह है कि एक एक गाड़ी घटक (LC3) के बजाय वास्तविक autophagic कार्गो अध्ययन कर रहा है । यह एक जगह गंभीर नुकसान है, क्योंकि राज्यों और/या माल की ज़ब्ती और प्रवाह बनाम मार्ग के माध्यम से LC3 के प्रवाह के बीच संबंध बेहद अस्पष्ट है । वास्तव में, हमें पता चला है कि थोक माल फ्लक्स शर्तों के तहत उच्च स्तर पर बनाए रखा जा सकता है जहां कोई LC3 प्रवाह है,9कोशिकाओं में संयुग्मित LC3 की उपस्थिति के बावजूद । इसके अलावा, हम प्रदर्शन किया है कि थोक autophagy कुशल LC3 कमी से अप्रभावित है, और इस तरह की संभावना LC3-निर्दलीय9है । इस खोज ने बाद में LC3 नॉक आउट स्टडीज10,11द्वारा पुष्टि की गई है, जो यह भी संकेत देती है कि Parkin-निर्भर mitophagy (mitochondria के चुनिंदा autophagy) LC310,11 से स्वतंत्र है .
सारांश में, वहां कार्गो आधारित परख के लिए एक स्पष्ट की जरूरत है autophagic गतिविधि पर नजर रखने के लिए । इष्टतम ऐसी परख मोटे तौर पर लागू किया जाना चाहिए, अच्छी तरह से परिभाषित है, और प्रदर्शन करने के लिए आसान है । पिछले कुछ वर्षों से हम LDH ज़ब्ती परख है, जो 1980 के12में Seglen प्रति द्वारा विकसित किया गया था में एक विशेष रुचि ले लिया है, और cytosolic LDH के हस्तांतरण के लिए अवसादन, autophagic vacuole-युक्त सेल को मापने पर आधारित है भिन्न. LDH एक स्थिर, घुलनशील cytosolic प्रोटीन है कि आसानी से सह तनहा है जब phagophores enwrap cytoplasmic कार्गो । LDH की ज़ब्ती इसलिए autophagic ज़ब्ती के एक सामांय उपाय है । LDH विशेष रूप से autophagic-lysosomal मार्ग12से नीचा है । इस प्रकार, lysosomal क्षरण अवरोधकों की उपस्थिति में, जैसे, bafilomycin A1 (बाफ)13, प्रयोगात्मक उपचार प्रभाव सीधे autophagic ज़ब्ती गतिविधि में परिवर्तन को प्रतिबिंबित । क्षरण अवरोधकों के अभाव में, LDH ज़ब्ती और क्षरण में परिवर्तन के शुद्ध प्रभाव मापा जा सकता है.
LDH ज़ब्ती परख मोटे तौर पर लागू है, के बाद से LDH उच्च और बैरे सभी प्रकार के सेल में व्यक्त की है, और LDH स्तर सही एक quantified परख14,15द्वारा एंजाइमी जा सकता है । हालांकि, मूल प्रोटोकॉल12 -प्राथमिक चूहे हेपैटोसाइट्स में स्थापित-बल्कि समय लेने वाली थी और सामग्री के रूप में अच्छी तरह से एक कस्टम बनाया बिजली निर्वहन संधारित्र की एक उच्च राशि की आवश्यकता है । एक कदम बुद्धिमान तरीके से, हम धीरे से एक आसान और बहुमुखी विधि में परख बदल दिया है । सबसे पहले, मूल प्रोटोकॉल स्तनधारी कक्ष लाइनों16में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था । दूसरा, विधि काफी downscaled3,9था । तीसरा, प्रोटोकॉल में कई कदम एक श्रमसाध्य घनत्व तकिया कदम17सहित, समाप्त किया गया । यह एक साथ विधि के एक भी आगे downscaling सक्षम, नमूना प्रति एक 12 अच्छी तरह से थाली से एक अच्छी तरह से उपयोग करने के लिए16 नमूना प्रति 10 सेमी प्लेट का उपयोग कर के मूल प्रारंभिक बिंदु से (यानी, लगभग 15 गुना कम शुरू सामग्री)17. चौथा, हम एक वाणिज्यिक electroporation तंत्र की पहचान की है कि कस्टम बनाया बिजली निर्वहन संधारित्र17की जगह सकता है ।
यहां हमारे सबसे ऊपर है LDH ज़ब्ती परख, जो विधि के कुछ और सरलीकरण के रूप में पहले प्रकाशित की तुलना में शामिल है की तारीख प्रोटोकॉल प्रस्तुत की है । इसके अलावा, विशिष्ट विभिन्न प्रकार के सेल के एक नंबर में प्राप्त परिणामों का एक सेट दिखाया गया है, और महत्वपूर्ण बात, औषधीय के रूप में अच्छी तरह के रूप में आनुवंशिक पछाड़ना और नॉकआउट दृष्टिकोण का उपयोग विधि के प्रयोगात्मक वैधता के कई लाइनें प्रदान की जाती हैं । पूरे प्रोटोकॉल की एक समग्र प्रवाह योजना के लिए, चित्र 1देखें ।
Protocol
Representative Results
Discussion
सारांश में, प्रोटोकॉल यहां वर्णित एक विश्वसनीय और व्यापक रूप से लागू करने के लिए स्तनधारी कोशिकाओं में थोक autophagic ज़ब्ती गतिविधि की निगरानी विधि का प्रतिनिधित्व करता है । मूल विधि12,16</s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम आर्थिक रूप से नॉर्वे की अनुसंधान परिषद, ओस्लो विश्वविद्यालय, ऐंडर्स Jahre फाउंडेशन, Nansen फाउंडेशन, और Henrik Homan की स्मृति में विरासत द्वारा समर्थित किया गया । हम ATG5 +/+ MEFs और ATG5-/MEFs के लिए डॉ॰ Noboru Mizushima का धन्यवाद करते हैं, डॉ॰ Masaaki कोमात्सु के लिए ATG7 +/+ MEFs और ATG7-/MEFs, और डॉ॰ Shizuo अकीरा के लिए ATG9A +/+ MEFs और ATG9A-/MEFs । हम तकनीकी सहायता के लिए फ्रैंक Sætre का धन्यवाद करते हैं और रचनात्मक methodological चर्चाओं के लिए प्रति ओ. Seglen डॉ.
Materials
| 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 211-2130 and 211-2120 | |
| 12-well plates | Falcon | 353043 | |
| Accumax cell detachment solution | Innovative Cell Technologies | A7089 | Keep aliquots at -20 °C for years, and in fridge for a few months |
| Bafilomycin A1 | Enzo | BML-CM110-0100 | Dissolve in DMSO |
| BJ cells | ATCC | CRL-2522 | use at passage <30 |
| Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 422361V | |
| Burker counting chamber | Fisher Scientific | 139-658585 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientfic | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientfic | AMQAX1000 | |
| Cover glass for the Burker counting chamber | Fisher Scientific | 139-658586 | |
| Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26-well, 15 µl, 13.3 x 8.7 cm (W x L) | Bio-Rad | 3450034 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Earle's balanced salt solution (EBSS) | Gibco | 24010-043 | conatains 0.1% glucose |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Electroporation cuvette (4 mm) | Bio-Rad | 1652088 | |
| Exponential decay wave electroporator | BTX Harvard Apparatus | EMC 630 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | 10% final concentration in RPMI 1640 medium |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750 | Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months |
| Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator | NuAire | NU-5510E | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher | 13778150 | |
| LNCaP cells | ATCC | CRL-1740 | use at passage <30 |
| 3-Methyl Adenine (3MA) | Sigma-Aldrich | M9281 | Stock 100 mM in RPMI in -20 °C. Heat stock to 65 °C for 10 minutes, and use at 10 mM final concentration |
| Refridgerated Microcentrifuge | Beckman Coulter Life Sciences | 368831 | |
| Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function | Eppendorf | Eppendorf 5417R | |
| MRT67307 hydrochloride (ULKi) | Sigma-Aldrich | SML0702 | Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO. |
| MaxMat Multianalyzer instrument | Erba Diagnostics | PL-II | |
| MCF7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| NADH | Merck-Millipore | 1.24644.001 | |
| Nycodenz | Axis-Shield | 1002424 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher | 31985062 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012-019 | |
| Pipette tips 3 (0.5-20 µl) | VWR | 732-2223 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipette tips (1-200 µl) | VWR | 732-2207 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipette tips (100-1000µl) | VWR | 732-2355 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipettes | ThermoFisher | 4701070 | Finnpipette F2 GLP Kit |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407-10X5MG | Make a 1 mg/ml stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 °C for at least 1 year. |
| Pyruvate | Merck-Millipore | 1066190050 | |
| RPE-1 cells (hTERT RPE-1) | ATCC | CRL-4000 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-037 | |
| SAR-405 | ApexBio | A8883 | Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO. |
| Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl) | ThermoFisher/Ambion | 4390843 | |
| Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A) | ThermoFisher/Ambion | s35504 | |
| Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200) | ThermoFisher/Ambion | s18995 | |
| Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1) | ThermoFisher/Ambion | s15964 | |
| Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2) | ThermoFisher/Ambion | s18705 | |
| Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP) | ThermoFisher/Ambion | s22362 | |
| Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1) | ThermoFisher/Ambion | s24333 | |
| Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2) | ThermoFisher/Ambion | s22387 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 • 2H2O) | Merck-Millipore | 1.06580.1000 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 • 2H2O ) | Prolabo | 28014.291 | |
| Sucrose | VWR | 443816T | 10% final concentration in water; filter through 0.45 µm filter and keep in fridge for months |
| Thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO. |
| Triton X-405 | Sigma-Aldrich | X405 | 1% final |
| Trypan Blue stain 0.4% | Molecular Probes | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin) | Gibco | 25200-056 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | 0.01% final |
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