सहवास आधारित खमीर में एक्सप्रेस पुस्तकालय स्क्रीनिंग
Summary
यह लेख एक संभोग आधारित विधि प्रस्तुत करने के लिए नवोदित खमीर में व्यक्त स्क्रीनिंग की सुविधा एक सरणी प्लाज्मिड पुस्तकालय का उपयोग कर ।
Abstract
नवोदित खमीर व्यापक रूप से मानव रोगों के साथ जुड़े प्रोटीन का अध्ययन में एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है । जीनोम-वाइड आनुवंशिक स्क्रीनिंग एक शक्तिशाली आमतौर पर खमीर अध्ययन में प्रयोग किया जाता उपकरण है । neurodegenerative रोग के एक नंबर की अभिव्यक्ति खमीर में प्रोटीन जुड़े cytotoxicity और समग्र गठन, recapitulating इन विकारों के साथ रोगियों में देखा निष्कर्षों का कारण बनता है । यहां, हम अपनी विषाक्तता के संशोधक के लिए पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस-जुड़े प्रोटीन FUS के एक खमीर मॉडल स्क्रीनिंग के लिए एक विधि का वर्णन । इसके बजाय परिवर्तन का उपयोग कर के, इस नए स्क्रीनिंग मंच खमीर के सहवास पर निर्भर करता है खमीर मॉडल में plasmids की एक सरणी पुस्तकालय परिचय । सहवास विधि में दो स्पष्ट लाभ हैं: पहला, यह अत्यधिक कुशल है; दूसरा, पूर्व plasmids की सरणी पुस्तकालय बदल एक ग्लिसरॉल शेयर के रूप में लंबी अवधि के लिए संग्रहीत किया जा सकता है, और जल्दी से श्रम के बिना अंय स्क्रीन पर लागू-खमीर मॉडल में परिवर्तन के गहन कदम हर बार । हम प्रदर्शन कैसे इस विधि सफलतापूर्वक जीन है कि FUS की विषाक्तता को संशोधित करने के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiae व्यापक रूप से बुनियादी वैज्ञानिक अनुसंधान में प्रयोग किया गया है1 सेलुलर प्रक्रियाओं को समझने के लिए सीधे मानव रोगों से संबंधित । इसके अलावा, यह मानव रोग से जुड़े प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल जीव के रूप में इस्तेमाल किया गया है, ऐसे सबसे आम neurodegenerative रोगों से जुड़े लोगों के रूप में, अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, Huntington की बीमारी, और पेशीशोषी सहित पार्श्व स्केलेरोसिस (ALS)2. खमीर मॉडल का एक लाभ के साथ आसानी से जो एक जीनोम के साथ व्यापक स्क्रीन को सेलुलर रास्ते रोग से संबंधित प्रोटीन की विषाक्तता से संबंधित पहचान प्रदर्शन किया जा सकता है, इस प्रकार उनके विषाक्तता के तंत्र में अंतर्दृष्टि दे रही है । ऐसा ही एक स्क्रीन एक एक्सप्रेस पुस्तकालय स्क्रीन, जिसमें एक सरणी पुस्तकालय में ५,५०० खमीर जीन के प्रत्येक एक खमीर मॉडल में तब्दील हो जाता है की पहचान करने के लिए जो जीन विषाक्तता को संशोधित कर सकते है जब व्यक्त की है । इस स्क्रीनिंग पद्धति को सफलतापूर्वक कई neurodegenerative रोग-संबद्ध प्रोटीन के खमीर मॉडल में लागू किया गया है, जिसमें Huntington के रोग के लिए huntingtin3, α-synuclein पार्किंसंस रोग के लिए4,5 , अल्जाइमर रोग के लिए Aβ6, और FUS और टीडीपी-४३ के लिए ALS7,8,9. हालांकि यह आमतौर पर एक उच्च प्रवाह तरीके10में किया जाता है, सबसे श्रम-स्क्रीन के गहन कदम व्यक्तिगत रूप से एक सरणी पुस्तकालय से ५,५०० खमीर जीन बदल रहा है । यह कदम हर बार स्क्रीनिंग दोहराया है प्रदर्शन किया जाना चाहिए, और जब भी एक नए स्थापित खमीर मॉडल का अध्ययन करने की जरूरत है । यह इस कार्य को पूरा करने के लिए एक अधिक कुशल तरीका खोजने के लिए महत्वपूर्ण है ।
खमीर कोशिकाओं अगुणित और द्विगुणित दोनों रूपों में छुरा मौजूद कर सकते हैं । अगुणित कोशिकाओं के दो विपरीत संभोग प्रकार हैं, संभोग प्रकार एक और α. अगुणित कोशिकाओं प्रत्येक संभोग प्रकार के उत्पादन और अपने स्वयं के विशिष्ट संभोग फेरोमोन, जो करने के लिए केवल विपरीत संभोग प्रकार कोशिकाओं का जवाब स्रावित । यह एक और α कोशिकाओं के बीच सहवास करने के लिए स्थिर द्विगुणित कोशिकाओं का उत्पादन की अनुमति देता है, एक/α । इस प्रक्रिया को सहज और अत्यधिक कुशल11है । प्लाज्मिड पुस्तकालय का परिचय देने के लिए हम एस cerevisiae के इस अनूठे जीवन चक्र का लाभ उठा सकते हैं । अधिक विशेष रूप से, सरणी प्लाज्मिड पुस्तकालय में प्रत्येक जीन एक संभोग प्रकार, यानी, α सेल के अगुणित कोशिकाओं में तब्दील हो जाएगा । पुस्तकालय जीन युक्त इन कोशिकाओं को तो ग्लिसरॉल स्टॉक में एक सरणी ९६-अच्छी तरह से प्रारूप में संग्रहीत किया जाएगा । प्रत्येक खमीर मॉडल है कि की जरूरत है के लिए जांच की, पुस्तकालय जीन युक्त खमीर कोशिकाओं ग्लिसरॉल स्टॉक से गल सकता है, और स्क्रीनिंग विपरीत संभोग प्रकार में ब्याज की खमीर मॉडल के साथ संभोग के माध्यम से किया जा सकता है, यानी, संभोग प्रकार एक । एक साथ खमीर में दो जीन लाने के लिए सहवास का उपयोग करने का यह विचार नया नहीं है. यह सफलतापूर्वक उच्च प्रवाह खमीर दो में लागू किया गया है संकर स्क्रीनिंग, जिसमें एक चारा का निर्माण (यानी, Gal4 डीएनए-एक संभोग प्रकार में बंधन डोमेन संलयन) एक शिकार के साथ सहवास के माध्यम से एक साथ लाया जाता है एक सरणी पुस्तकालय से निर्माण 12. हालांकि, इस रणनीति हमेशा पारंपरिक परिवर्तन तरीकों का इस्तेमाल किया है, जो व्यक्त पुस्तकालय की स्क्रीनिंग, में लागू नहीं किया गया है.
हमारी प्रयोगशाला पहले ALS के एक खमीर मॉडल-जुड़े प्रोटीन FUS7की स्थापना की । परिवर्तन विधि का उपयोग कर के माध्यम से व्यक्त पुस्तकालय स्क्रीनिंग हम पांच खमीर जीन की खोज (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1, और VHR1) कि FUS के बचाव विषाक्तता जब व्यक्त । इन निष्कर्षों को स्वतंत्र रूप से एक और8समूह द्वारा एक समान अध्ययन के साथ पुष्टि की गई । hUPF1, ECM32के एक मानव homolog, बाद में प्राथमिक न्यूरॉन्स कोशिकाओं में विषाक्तता को दबाने के लिए दिखाया गया था13 और ALS के एक पशु मॉडल में14 के रूप में अच्छी तरह से. सिद्धांत के सबूत के रूप में इन पांच जीनों का प्रयोग, हम प्रदर्शित करता है कि सभी पांच जीन इसी तरह FUS विषाक्तता बचाव जब वे संभोग द्वारा FUS खमीर मॉडल में पेश कर रहे हैं । चूंकि खमीर पुस्तकालय जीन युक्त कोशिकाओं ग्लिसरॉल स्टॉक में स्थाई रूप से संग्रहीत किया जा सकता है और जब भी जरूरत पुनर्जीवित, इस संभोग आधारित विधि समय परिवर्तन की खपत कदम हर बार पुस्तकालय के खिलाफ जांच की जरूरत को हटा देंगे । संभोग के बाद से कोई प्लाज्मिड शामिल परिवर्तन के साथ अत्यधिक कुशल है, इस रणनीति भी काफी शोधन और एक बड़ी प्लाज्मिड पुस्तकालय के परिवर्तन के साथ जुड़े लागत कम हो जाती है । हम सफलतापूर्वक FUS के खमीर मॉडल के खिलाफ एक पुस्तकालय स्क्रीनिंग के लिए इस पद्धति को लागू करेगा ।
संभोग के लिए प्रक्रिया आधारित स्क्रीनिंग संक्षेप में चित्रा 1में वर्णित है । शुरू में, सरणी प्लाज्मिड पुस्तकालय संभोग प्रकार के एक अगुणित खमीर तनाव में तब्दील हो जाता है α एक उच्च प्रवाह खमीर परिवर्तन प्रोटोकॉल जिसमें एक ९६ के एक अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुआं का उपयोग एक विशिष्ट पुस्तकालय प्लाज्मिड के साथ बदल खमीर शामिल हैं । रूपांतरित खमीर का यह संग्रह एक ग्लिसरॉल स्टॉक के रूप में सहेजा गया है जो बाद में उपयोग के लिए गल और पुनर्जीवित किया जा सकता है । ब्याज की खमीर मॉडल, इस मामले FUS विषाक्तता में, विपरीत संभोग प्रकार (संभोग प्रकार एक) के साथ एक अगुणित खमीर तनाव में उत्पंन किया जाना चाहिए । एक उच्च प्रवाह बाँझ ९६-पिन प्रतिकृतियों का उपयोग कर तरीके में, FUS तनाव और प्लाज्मिड पुस्तकालय युक्त खमीर उपभेदों ९६ के लिए स्थानांतरित कर रहे है अच्छी तरह से अमीर मीडिया युक्त प्लेटों और दोस्त को अनुमति दी । संभोग के बाद, संभोग संस्कृति का एक अच्छी तरह से एक छोटी सी मात्रा ९६ को हस्तांतरित-अच्छी तरह से सिंथेटिक dropout मीडिया जिसमें केवल द्विगुणित दोनों FUS और पुस्तकालय जीन युक्त खमीर विकसित कर सकते है युक्त प्लेट है । एक रोबोट खोलना मशीन तो प्रत्येक अच्छी तरह से जहां FUS की अभिव्यक्ति और पुस्तकालय जीन प्रेरित किया जाता है आगर प्लेटों पर से खमीर संस्कृति हस्तांतरण करने के लिए इस्तेमाल होता है । इसके अतिरिक्त, खमीर संस्कृति जहां FUS और पुस्तकालय जीन व्यक्त नहीं कर रहे है प्लेटों आगार नियंत्रित करने के लिए देखा जाता है । आगर प्लेटों पर विकास के बाद, जीन है कि बचाव या ख़राब FUS विषाक्तता की पहचान की जाएगी ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए खमीर में एक प्लाज्मिड व्यक्त स्क्रीन संभोग का उपयोग करने खमीर मॉडल में प्लाज्मिड पुस्तकालय परिचय प्रदर्शन । इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, neurodegenerative रोग प्रोटीन वि?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम जू प्रयोगशाला और Zhong प्रयोगशाला के सदस्यों के साथ विचारशील विचार विमर्श के लिए आभारी हैं, और राइट राज्य विश्वविद्यालय से वित्तीय सहायता ।
Materials
| salmon Sperm DNA (SS-DNA) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| YPD broth | Research Products International (RPI) | Y20090 | |
| Granulated Agar | Fisher Sci | BP97445 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International (RPI) | G32040 | |
| D-(+)-Galactose | Research Products International (RPI) | G33000 | |
| D-(+)-Raffinose Pentahydrate | Research Products International (RPI) | R20500 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Sci | A702-500 | |
| Synthetic Ura- drop out medium | Clontech | 630416 | |
| Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil | Clontech | 630422 | |
| Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate | Research Products International (RPI) | Y20060 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Sci | S67496 | |
| Lithium acetate, anhydrous | Fisher Sci | AC268640010 | |
| Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350) | Spectrum Chemical | PO125-12KG | |
| 96 Pin Replicator | Scinomix | SCI-5010-OS | |
| Nunc OmniTray | Thermo Sci | 140156 | |
| Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid | Fisher Sci | 07-200-760 | non-treated, sterile |
| Eppendorf Research plus Multichannel Pipette | Eppendorf | TI13690052 | 30-300ul volume |
| Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters | Fisher Sci | 88-860-023 | |
| Eppendorf MixMate | Eppendorf | 21-379-00 | |
| Eppendorf 5810R Centrifuge | Fisher Sci | 05-413-112 | |
| Avanti J-26 XPI Centrifuge | Beckman | 393127 | |
| MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser | BioTek | ||
| Rotor HDA | Singer Instruments |
References
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