Parning-baserade överuttryck bibliotek Screening i jäst
Summary
Denna artikel presenterar en parning-baserad metod för att underlätta överuttryck screening i spirande jäst med en klädd plasmid-biblioteket.
Abstract
Spirande jäst har använts som modell i studerar proteiner som är associerad med mänskliga sjukdomar. Genome-wide genetisk screening är ett kraftfullt verktyg som ofta används i jäst studier. Ett uttryck för ett antal neurodegenerativa sjukdomar-associerade proteiner i jäst orsakar cytotoxicitet och samlad formation, går igenom resultaten ses hos patienter med dessa sjukdomar. Här, beskriver vi en metod för screening en jäst modell av amyotrofisk lateralskleros-associerade protein FUS för modifierare av dess toxicitet. Istället för att använda transformation, bygger denna nya screening plattform på parning av jäst att införa en klädd bibliotek av plasmider i jäst modellen. Metoden parning har två tydliga fördelar: för det första är högeffektiva; det andra kan pre transformerad klädd biblioteket av plasmider lagras för långsiktig som en glycerol lager och snabbt tillämpas på andra skärmar utan det arbetsintensiva steget omvandling in i jäst modellen varje gång. Vi visar hur denna metod kan framgångsrikt användas till skärmen för gener som ändra toxiciteten av FUS.
Introduction
Spirande jästen Saccharomyces cerevisiae har använts i grundforskningen1 för att förstå cellulära processer direkt relaterade till mänskliga sjukdomar. Dessutom, det har använts som modellorganism för studerar mänskliga sjukdomsassocierade proteiner, såsom de som är kopplade till de vanligaste neurodegenerativa sjukdomar, däribland Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, Huntingtons sjukdom och amyotrofisk Lateral skleros (ALS)2. En fördel med jäst modellen är den lätthet med vilken en genome-wide skärm kan utföras för att identifiera cellulära vägar relaterade till toxiciteten av sjukdomsrelaterade proteiner, vilket ger inblick i mekanismen för deras giftighet. En sådan skärm kallas ett överuttryck skärmen bibliotek, där var och en av de 5 500 jäst generna i en klädd bibliotek förvandlas till en jäst-modell för att identifiera vilka gener kan ändra toxicitet när i ökad utsträckning. Denna screeningmetod har tillämpats framgångsrikt i jäst modeller av flera neurodegenerativa sjukdomar-associerade proteiner, inklusive huntingtin för Huntingtons sjukdom3, α-synuclein för Parkinsons sjukdom4,5 , Aβ för Alzheimers sjukdom6, och FUS och TDP-43 för ALS7,8,9. Medan det görs oftast i en hög genomströmning sätt10, förändrar det mest arbetsintensiva steget på skärmen individuellt 5.500 jäst gener från en klädd bibliotek. Det här steget måste utföras varje gång screening repeteras, och närhelst en nyinrättade jäst modell behöver studeras. Det är viktigt att hitta ett mer effektivt sätt att utföra denna uppgift.
Jästceller kan stabilt finns i både haploida och diploida former. Det finns två motsatta parning typer av haploida celler, parning typ en α. haploida celler för varje parning typ producera och utsöndra sina egna specifika parning feromon, som endast motsatt parning typ cellerna svarar på. Detta tillåter parning mellan en och α-celler att producera stabila diploida, a/α. Denna process är spontana och högeffektiv11. Vi kan dra nytta av denna unika livscykel S. cerevisiae att införa plasmiden biblioteket. Mer specifikt kommer varje gen i klädd plasmid biblioteket att omvandlas till haploida celler av en parning typ, dvs, α-cellen. Dessa celler innehåller bibliotek generna lagras sedan i glycerol lager i en klädd 96 brunnar-format. För varje modell av jäst som behöver undersökas, jästceller som innehåller bibliotek generna kan tinas upp från glycerol lager och screening kan göras genom parning med jäst modell av intresse i den motsatta parning typ, dvsparning typ en. Denna idé att använda parning för att föra samman två gener i jäst är inte ny. Det har tillämpats framgångsrikt i hög genomströmning jästen två-hybrid screening, där konstruera ett bete (dvs.Gal4-DNA-bindande domänen fusioner) i en parning typ förs samman genom parning med en byte konstruktion från ett klädd bibliotek 12. denna strategi har dock aldrig tillämpats i överuttryck bibliotek filmvisningar, som alltid har använt traditionella omvandling metoder.
Vårt laboratorium har inrättats en jäst modell av ALS-associerade protein FUS7. Genom överuttryck bibliotek screening med metoden omvandling upptäckte vi fem jäst gener (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1och VHR1) som rädda toxicitet av FUS när i ökad utsträckning. Dessa slutsatser bekräftades självständigt med en liknande studie av en annan grupp8. hUPF1, en mänsklig homolog av ECM32, visades senare att undertrycka toxicitet i primära neuronala celler13 och i en djurmodell av ALS14 också. Med dessa fem gener som bevis av princip, visar vi att alla fem gener på samma sätt rädda FUS toxicitet när de införs i FUS jäst modellen genom parning. Eftersom jästceller som innehåller bibliotek generna kan lagras permanent i glycerol lager och återupplivade när det behövs, tar denna parning-baserade metod bort tidskrävande steget att omvandlingen varje gång biblioteket behöver vara avskärmade mot. Eftersom parning är högeffektiva med någon plasmid förvandling inblandade, minskar denna strategi också avsevärt kostnaden i samband med rening och omvandling av en stor plasmid bibliotek. Vi kommer att framgångsrikt tillämpa denna metod på ett bibliotek som screening mot jäst modell av FUS.
Proceduren för parning-baserad screening är kortfattat beskrivs i figur 1. Inledningsvis, förvandlas klädd plasmid biblioteket till en haploida jäst stam för parning typ α med ett högt dataflöde jäst omvandling protokoll där varje brunn en plattan med 96 brunnar innehåller jäst förvandlas med ett specifikt bibliotek plasmid. Denna samling av omvandlade jäst sparas som en glycerol lager som kan tinas upp och återupplivas för användning senare. Den jäst modellen av intresse, i detta fall FUS toxicitet, måste genereras i en haploida jäst stam med motsatt parning typ (parning typ en). I en hög genomströmning sätt använder sterila 96-pin replikerare, FUS belastningen och jäststammar innehållande plasmid biblioteket överförs till 96 brunnar som innehåller rika medier och tillåtet att mate. Efter parning, en liten volym från varje brunn av parning kultur överförs till 96 brunnar som innehåller syntetiska dropout media i vilka endast diploida jäst som innehåller båda FUS och bibliotek gener kan växa. En robotic tubkikare maskin används sedan överföra jästkultur från varje brunn på agarplattor där uttrycket av FUS och bibliotek generna induceras. Dessutom är jästkultur fläckig för att styra agarplattor där FUS och bibliotek generna inte uttrycks. Efter tillväxt på agarplattor, gener som rädda eller förvärra FUS toxicitet identifieras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi ett protokoll för att utföra en plasmid överuttryck skärm i jäst med parning för att införa plasmiden biblioteket i jäst modellen. Använder denna metod, kan flera jäst modeller av neurodegenerativa sjukdomar protein toxicitet säkerhetskontrolleras med samma samling av jäst förvandlas med en plasmid bibliotek. Den mödosamma processen med omvandling behöver bara utföras en gång, efter vilken högeffektiva jäst parning används för att införa plasmiden biblioteket i fråga stammen. Dett…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för de tankeväckande diskussionerna med medlemmar av JUEN laboratoriet och Zhong laboratorium och det ekonomiska stödet från Wright State University.
Materials
| salmon Sperm DNA (SS-DNA) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| YPD broth | Research Products International (RPI) | Y20090 | |
| Granulated Agar | Fisher Sci | BP97445 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International (RPI) | G32040 | |
| D-(+)-Galactose | Research Products International (RPI) | G33000 | |
| D-(+)-Raffinose Pentahydrate | Research Products International (RPI) | R20500 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Sci | A702-500 | |
| Synthetic Ura- drop out medium | Clontech | 630416 | |
| Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil | Clontech | 630422 | |
| Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate | Research Products International (RPI) | Y20060 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Sci | S67496 | |
| Lithium acetate, anhydrous | Fisher Sci | AC268640010 | |
| Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350) | Spectrum Chemical | PO125-12KG | |
| 96 Pin Replicator | Scinomix | SCI-5010-OS | |
| Nunc OmniTray | Thermo Sci | 140156 | |
| Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid | Fisher Sci | 07-200-760 | non-treated, sterile |
| Eppendorf Research plus Multichannel Pipette | Eppendorf | TI13690052 | 30-300ul volume |
| Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters | Fisher Sci | 88-860-023 | |
| Eppendorf MixMate | Eppendorf | 21-379-00 | |
| Eppendorf 5810R Centrifuge | Fisher Sci | 05-413-112 | |
| Avanti J-26 XPI Centrifuge | Beckman | 393127 | |
| MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser | BioTek | ||
| Rotor HDA | Singer Instruments |
References
- Dujon, B. A., Louis, E. J. Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina). Génétique. 206 (2), 717-750 (2017).
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker’s yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
- Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. J. Yeast genes that enhance the toxicity of a mutant huntingtin fragment or alpha-synuclein. Science. 302 (5651), 1769-1772 (2003).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313 (5785), 324-328 (2006).
- Treusch, S., et al. Functional links between Abeta toxicity, endocytic trafficking, and Alzheimer’s disease risk factors in yeast. Science. 334 (6060), 1241-1245 (2011).
- Ju, S., et al. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity. PLoS Biology. 9 (4), 1001052 (2011).
- Sun, Z., et al. Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS. PLoS Biology. 9 (4), 1000614 (2011).
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (17), 6439-6444 (2008).
- Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpression screen. Journal of Visualized Experiments. (53), e2836 (2011).
- Herskowitz, I. Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).
- Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond. Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).
- Jackson, K. L., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).
