Single-cell Transcriptomic analyser av mus bukspottkörtelns endokrina celler
Summary
Vi beskriver en metod för isolering av endokrina celler från embryon, neonatal och postnatal bukspottkörtlar följt av encelliga RNA-sekvensering. Denna metod tillåter analyser av pankreas endokrina härstamning utveckling, cell heterogenitet och transcriptomic dynamik.
Abstract
Pankreas endokrina celler, som är grupperade i små öar, reglerar blod glukos stabilitet och energiomsättning. De olika celltyper i holmar, inklusive insulin-utsöndrar β-celler, särskiljs från gemensamma endokrina föräldraparets under embryostadiet. Omogna endokrina celler expandera via cellförökning och mogna under en lång postnatal utvecklingstoxicitet. Mekanismerna bakom dessa processer är dock inte klart definierade. Encelliga RNA-sekvensering är en lovande metod för karakterisering av olika cellpopulationer och spåra cell härstamning differentiering vägar. Här, beskriver vi en metod för encelliga RNA-sekvensering av isolerade pankreas β-celler från embryonala, neonatal och postnatal bukspottkörtlar.
Introduction
Bukspottkörteln är ett viktigt metaboliska organ hos däggdjur. Bukspottkörteln består av endokrin och exokrin fack. Pankreas endokrina celler, inklusive insulinproducerande β och glukagon-producerande α celler, klustret tillsammans i de Langerhanska öar och reglerar coordinately systemisk glukoshomeostasen. Dysfunktion av endokrina celler resultaten vid diabetes mellitus, som har blivit en viktig folkhälsofråga i hela världen.
Bukspottkörtelns endokrina celler härleds från Ngn3+ stamfäder under embryogenes1. Senare, under den perinatala perioden föröka de endokrina cellerna till formuläret omogna holmar. Dessa omogna celler fortsätter att utveckla och gradvis bli mogen holmar, som blivit rikt vaskulariserad för att reglera blod glukos homeostas i vuxna2.
Även om en grupp av transkriptionell faktorer har identifierats som reglerar β celldifferentiering, är exakt mognad stigen av β-celler fortfarande oklart. Dessutom innebär de β-cellen mognadsprocessen också regleringen av cell nummer expansion3,4 och generering av cellulära heterogenitet5,6. Dock har regleringsmekanismer av dessa processer inte varit väl studerat.
Encelliga RNA-sekvensering är en kraftfull metod som kan profilera cell subpopulationer och spåra cell härstamning utvecklingsmässiga vägar7. Dra nytta av denna teknik, centrala händelser som inträffar under bukspottskörteln holme utveckling kan dechiffreras på enskild cell nivå8. Bland de encelliga RNA-sekvensering protokoll kan Smart-seq2 generering av fullängds cDNA med förbättrad känslighet och noggrannhet, och användningen av standardreagens på lägre kostnad9. Smart-seq2 tar ungefär två dagar att konstruera ett cDNA bibliotek för sekvensering10.
Här föreslår vi en metod för isolering av fluorescens-märkt β celler från bukspottkörtlar av foster till vuxen Ins1 Armeringsputs transgena möss11, med hjälp av fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS), och utförandet av transcriptomic analyser på den enskild cell nivå, med hjälp av Smart-seq2 teknik (figur 1). Detta protokoll kan utvidgas till att analysera transcriptomes av alla pankreas endokrina celltyper i normala och patologiska och åldrande staterna.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll visade vi en effektiv och lätt-till-använda metod för att studera de encelliga uttryck profilerna av pankreas β-celler. Denna metod kan användas att isolera endokrina celler från embryon, neonatal och postnatal bukspottkörtlar och utföra encelliga transcriptomic analyser.
Det mest kritiska steget är isoleringen av enda β-celler i bra skick. Fullt perfunderade bukspottkörtlar svarar bättre på efterföljande matsmältningen. Otillräcklig perfusion, som vanligtvis …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar det nationella centret för Protein Sciences, Beijing (Peking University) och Peking-Tsinghua Center för Life Science Computing-plattformen. Detta arbete stöds av ministeriet för vetenskap och teknik i Kina (2015CB942800), den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (31521004, 31471358 och 31522036) och finansiering från Peking-Tsinghua Center för Life Sciences till C.-R.X.
Materials
| Collagenase P | Roche | 11213873001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz | RS-4904 | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5058 | |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereo Fluorescence microscope | Zeiss | Stereo Lumar V12 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD-Falcon | 352235 | |
| 96-Well PCR Microplate | Axygen | PCR-96-C | |
| Silicone Sealing Mat | Axygen | AM-96-PCR-RD | |
| Thin Well PCR Tube | Extragene | P-02X8-CF | |
| Cell sorter | BD Biosciences | BD FACSAria | |
| Capillary pipette | Sutter | B100-58-10 | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Life Technologies | 4456740 | |
| Distilled water | Gibco | 10977 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara | 2313 | |
| Superscript II reverse transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| First-strand buffer (5x) | Invitrogen | 18064-014 | |
| DTT | Invitrogen | 18064-014 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 107-43-7 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9932 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| VAHTS DNA Clean Beads XP beads | Vazyme | N411-03 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| AceQ qPCR SYBR Green Master Mix | Vazyme | Q121-02 | |
| TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD502 | Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE |
| TruePrep Index Kit V3 for Illumina | Vazyme | TD203 | Include 16 N6XX and 24 N8XX |
| High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit | Advanced Analytical Technologies | DNF-474 | |
| 1x HBSS without Ca2+ and Mg2+ | 138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4 |
||
| Isolation buffer | 1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4 | ||
| FACS buffer | 1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3' | ||
| TSO | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3' | ||
| ISPCR primers | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' | ||
| Gapdh Forward primer | 5'-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3' | ||
| Gapdh Reverse primer | 5'-GCCTTGACTGTGCCGTTGAAT-3' | ||
| Ins2 Forward primer | 5'-TGGCTTCTTCTACACACCCA-3' | ||
| Ins2 Reverse primer | 5'-TCTAGTTGCAGTAGTTCTCCA-3' |
References
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. On the origin of the beta cell. Genes & Development. 22 (15), 1998-2021 (1998).
- Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
- Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).
- Qiu, W. L., et al. Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level. Cell Metabolism. 25 (5), 1194-1205 (2017).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Piccand, J., et al. Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice. Diabetes. 63 (1), 203-215 (2014).
- Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling. Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).
- Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. Single cell isolation and analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).
- Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).
- . FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010)
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14 (4), (2013).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq–a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
- Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples. Theory in Biosciences. 131 (4), 281-285 (2012).
- Brennecke, P., et al. Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).
- Le, S., Josse, J., Husson, F. FactoMineR: An R package for multivariate analysis. Journal of Statistical Software. 25 (1), (2008).
- Hadley, W. . ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , (2009).
- . gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data Available from: https://cran.r-project.org/package=gplots (2016)
- Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
- Li, L., et al. Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions. Cell Stem Cell. , (2017).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Teo, A. K. K., et al. Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures. Cell Death Discovery. 4 (14), (2018).
