אנו מציגים פרוטוקול למדידת צריכת החמצן ואת acidification חוץ-תאית במוח זחל ומבוגרים melanogaster דרוזופילה . מנתח חילוף החומרים מנוצל עם פרוטוקול מותאם וממוטב. מיקרו-רקמת ריסון הינם המכריעים של פרוטוקול זה, היו עיצבת ויצרת במיוחד לשימוש שלהם ניתוח זה.
פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת חילוף החומרים במוח זחל ומבוגרים melanogaster דרוזופילה . לכימות חילוף החומרים באיברים כל מספק הבנה ברמת רקמות של ניצול האנרגיה לא יכול להיות שנתפסו בעת ניתוח יסודי תאים, שורות תאים. בזמן ניתוח זה ex-vivo, הוא מאפשר המדידה ממספר תאים מיוחדים לעבוד ביחד לביצוע פונקציה ברקמה אחת, יותר מקרוב מודלים האיבר ויוו . התכנות מטבולית נצפתה מחלות נוירולוגיות רבות, לרבות neoplasia מחלות ניווניות. פרוטוקול זה פותחה כדי לסייע בחקירה של הקהילה melanogaster ד של חילוף החומרים במודלים מחלה נוירולוגית באמצעות מנתח חילוף החומרים זמינים מסחרית. מדידת חילוף החומרים של כל המוחות בכל במנתח מטבולית הוא מאתגר עקב הגיאומטריה של המוח. מנתח זה דורש דוגמאות ישארו בתחתית צלחת 96-ובכן. תא ודוגמאות רקמה אגרופים אפשר לדבוק פני השטח של הלוח התא או לנצל ספרואיד צלחות, בהתאמה. עם זאת, צורה כדורית, תלת מימדי של melanogaster ד המוח מונעת את הרקמה והקפדה על הלוח. פרוטוקול זה דורש איפוק מיקרו-רקמות מעוצב ומיוצר במיוחד כי עוקף את הבעיה על-ידי מניעת כל תנועה של המוח תוך מתן אפשרות מידות מטבולית שני רגשים במנתח חיישן של מצב מוצק. צריכת החמצן acidification חוץ-תאית המחירים הם רגישים טיפול עם מעכבי חילוף החומרים הדירים. עם אופטימיזציה קטין, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לשימוש עם כל כל רקמות ו/או מערכת מודל, ובלבד גודל המדגם אינו עולה על התא שנוצר על ידי הריסון. בזמן מדידות מטבולית הבזליים וניתוח לאחר טיפול עם מעכבי מיטוכונדריאלי מתוארים בתוך פרוטוקול זה, אין ספור תנאים ניסיוני, כגון העדפת מקור אנרגיה וסביבה לגידול, יכולה להיחקר.
התכנות מטבולית זוהתה ב מחלות נוירולוגיות רבות, כולל Glioblastoma גליובלסטומה (GBM), מחלת הנטינגטון, הפרעת דיכאון הגדולות (MDD)1,2,3. חילוף החומרים הופך המוקד של אסטרטגיות טיפוליות, קידמו כלים למחקר בסיסי מטבולית. עם זאת, רוב השיטות האלה נועדו ללמוד שורות תאים ותאים הראשי או לנתח גדול יותר רקמות קיבוע שאחרי או – הקיפאון. כמה גישות צריכים לסמוך על ערכות למדוד בצורה פשטנית מטבוליטים ספציפיים, בעוד אחרים נעזרו יותר יקרה ומורכבת ניתוחים ניצול כרומטוגרפיה בשילוב עם ספקטרומטר מסה4 לאותה מטרה. כדי להבין את הנוף מטבולית גדולה יותר, חילוף החומרים פרופיל5,6 וניתוח השטף מטבולית (MFA)7 צמחו כדי להשלים את פרוטיאומיה מבנית בקנה מידה גדול ואת גנומית מחקרים. פרופיל מספק ייצוג כמותי של מטבוליטים בתא או רקמות בנקודה מסוימת בזמן, בעוד MFA ומרחיב על זה מתן אפשרות המעקב של מטבוליטים שכותרתו לאורך זמן. האחרון היה שימושי חושף כמה מקורות אנרגיה שאינם מנוצלים באופן שונה בתא או רקמות כאשר מצב המחלה8. עם זאת, שיטות אלה אינם כוללים את המדידה של קצב חילוף החומרים באופן כללי.
לחקור המדינה בסך הכל מטבולית של מערכות מודל קטן, שיטות מסורתיות, כגון קלארק אלקטרודה9 ו calorimetry עקיף10, ניתן למדידת צריכת חמצן או מוגדר עבור עצירה זרימה respirometry, למדוד חמצן, פחמן דו-חמצני ריכוז, בהתאמה. שיטות אלה, תוך מתן במדויק תובנה המדידה של התכנות מטבולית ברמת האורגניזם, יש מגבלות. השימוש של האלקטרודה קלארק יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית, לא נועד ללימודי תפוקה גבוהה. Respirometer זרימה התחנה לא יכול לתפקד עם הרגישות נדרשים assay תאים או רקמות. לפני כמה שנים, טכנולוגיה חדשה שפותחה במיוחד עבור אלה יישומים קטנים11. המכשירים האלה נועדו תחילה למדוד את צריכת החמצן ואת חוץ-תאית לחומצי שורות תאים ותאים הראשי בתבנית 24 – או 96-ובכן. הפשטות של הפלט נתונים הקמה הוקמה שיטה זו כחלופה הגישות המסורתיות. מתודולוגיה זו היא כלי רב עוצמה עבור תאים, ההתקדמות אפשרו לשקילת רקמות אגרופים12,13,14. עם זאת, השיטות מנוצל מבחני אלה אינם מאפשרים לשקילת כל האיברים ממערכות מודל קטן.
ניתוח מטבולית של המחלה מודלים כרוך לעתים קרובות את האינטראקציה בין תאים של הפונקציה המקצועית המתגוררים בתוך רקמת אותו. לדוגמה, גלייה לייצר מטבוליטים מנוצל על ידי נוירונים. אינטראקציות מטבולית אלה דרושים עבור ה15-הישרדות עצביים. מודל קטן מערכות הן יתרון עבור חוקרים שאלות מעין אלה. מחקרים כדי למדוד את חילוף החומרים של איבר שלם, המכיל מגוון רחב של סוגי תאים, יוסיף ההבנה של ניצול האנרגיה בתוך vivo. לאחרונה, בקר. et al. דיווח על שיטת מדידת צריכת חמצן ראשי כל לטוס16. על ידי צירוף בעל מספר ראשים ביחד היטב אחד של צלחת תא 24-ובכן, קריאות צריכת חמצן התקבלו באמצעות מנתח מטבולית. בזמן זה עובד היטב עבור ראשי, אשר מופרדים בקלות מן הגוף, קשה הרבה יותר לשימוש עבור איברים כגון המוח זחל, כי כמות גדולה צריך להיות גזור על שיטה זו. לכן, שיטת ניצול צלחת תא 96-ובכן, אשר מגביר את הרגישות של צריכת החמצן, קריאות acidification חוץ-תאית, פותחה כדי assay מוח כל זחל בודד.
במנתח מטבולית השתמשו במחקר זה מחייב את הדגימה הנמדדים ישארו בתחתית הבאר של צלחת תא 96-ובכן. עבור תאים ורקמות שטוחה יחסית, זה לא אתגר; עם זאת, שכל זחל ומבוגרים melanogaster ד , בלתי אפשרי באמצעות פרוטוקולי ציפוי צלחת מסורתיים. צורת תלת כדורית של המוח לא דוגלים באמינות השטח צלחת, אלו. שעושים נפגעים לעתים בעת ניסיון למקם אותם כראוי בתוך הבאר. חלק קריטי של פרוטוקול חדש זה הוא העיצוב והפיתוח של מיקרו-רקמת ריסון17 המספקים חדר קטן על המוח לשכון בלי לשבש המידות מטבולית. תא שנוצר הוא כ 0.016 ב גובה מספק מספיק מקום כדי בקלות להחזיק את המוח melanogaster ד רבים. הרצועות מורכב רשת ניילון המצורפת טבעת פולימר אינרטי, יידונו בהמשך נציג תוצאות. שימוש באזיקים האלה ממזער את הזמן הנדרש כדי להתכונן המוח ביתור המדידה מטבולית. ייעול ההליך מדידה יוצרת את צריכת החמצן יציב, לשחזור וקצבי acidification חוץ-תאית לאחר שישה מחזורים מדידה (של 25 דקות). המוח להישאר סמויה פעילה בתנאים אלה למשך תקופה מינימלית של 2 h, המאפשרת זריקות של הרפוי, מעכבי או אחרים טיפולים דרך היציאות משלוח סמים מחסנית מנתח מטבולית. ניתן להתאים בקלות עבור אחרים רקמות, דגם קטן מערכות18גם פרוטוקול זה.
פרוטוקול שיפורטו להלן מתאר כיצד assay צריכת חמצן במוח כל דרוזופילה זחל כאשר הם אתגר מיטוכונדריאלי מתח. להדגיש את המוח, oligomycin נוספת כדי לעכב את ATP סינתאז19. הירידה בצריכת החמצן בהנחה הבזליים מראה מדידה של כמות נשימה בהתאם-ATP במוח. ירידות נוספות צריכת חמצן לאחר טיפולים עם rotenone20 ו- antimycin21, מעכבי של אלקטרון תחבורה שרשרת מתחמי I ו- III, בהתאמה, ציין את כמות צריכת חמצן מיטוכונדריאלי המוח. Assay הזה הוא דוגמה אחת של איך מיטוכונדריאלי הנשימה במוח לעוף אולי ניתן להשוות, כיצד ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי להשוות את חילוף החומרים משתנים אחרים. עם זאת, ניתן להתאים פרוטוקול זה כדי למדוד את צריכת החמצן פשוט הבזליים וקצבי acidification חוץ-תאית, כמו גם לגבי עיצוב משוכלל יותר מחקרים חוקרת ניצול אנרגיה ספציפיים או המצע ניצול השערות.
כאן, מתוארת שיטה לניתוח מטבולית של melanogaster ד המוח זחל ומבוגרים ex-vivo . בתנאים הבזליים, צריכת החמצן ואת המחירים acidification חוץ-תאית לציין איך סמויה פעיל המוח יכול לקבוע אם רקמה הפכה יותר תלויה מיטוכונדריאלי לעומת glycolytic הנשימה בהתאמה11.
מתייחסים המוח עם מעכבי או תרופות טיפוליות יכול לספק מידע נוסף אודות מצב מטבולי של הרקמה. ניתן גם להוסיף חילוף חומרים דיאלקטריים לקביעת יחסי תלות מטבוליטים ספציפיים, כגון גלוקוז כדי לבדוק אפקט ורבורג22 או גלוטמין לחקור glutaminolysis23— שני משותף ב התכנות מטבולית. לפי מחקרים ארוכי טווח, הזחלים או זבובים יכול גם להיות מוזן סמים במקום באמצעות הזרקת יציאות, המוח יכול להיות לבדיקה במרווחי זמן או את מובילים, בהתאם לעיצוב הניסיונית. בשיטה זו ניתן למטב עבור יישומים רבים.
שיטה זו מוטבה שכל אולם ניתן להשתמש כדי לנתח את הזחל18 ורקמות למבוגרים אחרים. בנוסף, מערכות אחרות מודל קטן יכולים לנצל בשיטה זו כדי למדוד את כל האורגניזמים18 או רקמות. המגבלה היחידה אופטימיזציה של שיטה זו עבור מערכות אחרות הוא הגודל של איבר, רקמה או אורגניזם. תא שנוצרו על-ידי מיקרו-רקמת הריסון היא המכשול גודל לרוץ וזמינותו. אם הפלט מטבולית הוא נמוך מדי של המוח או של הרקמה הנבדקת, גודל המדגם אינו אילוץ, איגוד דגימות יכול לשמש כדי להגביר את המידות assay ואת הרגישות. שינוי פרוטוקול זה עבור יישומים אחרים צריך רק דורשים אופטימיזציות קטין, כולל 1) בחירת המדד המתאים ומערבבים מחזור מספרים התזמון ואת 2) לקביעת ריכוזים טיפול יעיל עבור הרקמה. מדד ובשעות ערבוב של נקבעו על ידי ריכוז חמצן ניטור נמדדת במנתח מטבולית במהלך כל מחזור. זה ניתן להציג על-ידי בחירת O2 לחצן ציר Y2 בחלון סקירה בתום המרוץ. במהלך כל מחזור, צריך להיות ריכוז חמצן פתע המשקף את צריכת החמצן של הרקמה במשך הזמן נמדד, ולאחריו חזרה ריכוז החמצן ההתחלתי במהלך מחזור ערבוב. מיקס, מדידת הזמנים צריך להיבדק עד תבנית זו נוצרת. באמצעות שיטה זו, את המוח חרקים אחרים נחקרו. המוח האלה היו גדולים יותר משכל לעוף פה אבל עדיין מתאימים בתוך התא שנוצר על ידי הריסון רקמות. הקריאות OCR מן המוח האלה היו בגובה 400 pmol/min (נתונים לא מוצג). תוצאות מחקרים אלה, כמו גם שיעורי OCR להתיישר עם מחקרים אחרים מדידת צריכת חמצן כל-פליי18,24, מראים כי המוח melanogaster ד היו לא מוגבל חמצן. עבור המוח melanogaster ד והן רקמות אורגניזמים אחרים, יישום שיטה זו דורשת תשומת לב מיוחדת ארבעה שלבים קריטיים.
להשיג בהצלחה מדידות ביולוגית רלוונטית הדירים, יש שלבים קריטיים של פרוטוקול זה חייב להיות במעקב. ראשית, השימוש של מיקרו-רקמת מעצורים נדרש עבור שיטה זו. ייצור הרסנים האלו באמצעות מפרט חומרים המפורטים חיוני. החומרים נבחרו בשל ההרכב הכימי שלהם אינרטי, והיכולת שלהם כדי לאפשר חילופי המדיה המתאים במהלך השלבים ערבוב ללא יצירת בועות אוויר. שנית, הכנה בזמן לנתיחה וצלחת נדרש להגדיל את הפלט מטבולית של הרקמה. ניתוח קצר פעמים צריך פוגע באופן משמעותי את המוח. מחקרים אחרים הראו כי המוח לעוף יכול להשאר בחיים במשך שעות עד ימים לאחר ניתוח אם מאוחסנים כראוי זלוף קאמרית25. עם זאת, כפי שניתן לראות באיור 3B ו- 3D, אם המוח נותרו יושב בתקשורת assay במשך פרקי זמן ארוכים לפני וזמינותו, הן ירד שיעור צריכת החמצן. במהלך וזמינותו, דגימות עוברים שלב ערבוב במהלך כל מחזור. ערבוב זה לא רק מסייע עם הזריקות של תרכובות כימיות, אלא פועלת גם recirculate בתקשורת ולספק חמצן. המוח מסוגלים להישאר סמויה פעיל למשך פרקי זמן ממושכים במהלך מחזורי מידה-מיקס מאשר הם המקננת בתקשורת על גבי ספסל. לפיכך, ניתוח מוח זחל צריך להיות מומחה לפני שמתחילים להגדיר זה וזמינותו. כאשר הגדרה זו assay, לנתח מספר קטן של אחרים בכל פעם, כדי לצמצם את מספר המוח זקוק, בארות מנוצל. פעולה זו תמנע עיכובים בין לנתח את המדידות וזמינותו. שלישית, שמירה על טמפרטורה יציבה דרוש כדי לנתח את קצב חילוף החומרים שיש בתנאים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. טמפרטורות assay מוגברת עלולה לגרום מוות הרקמה, שנצפה על ידי שיעורי צריכת חמצן נמוכה (איור 3C). אם זבובים גדלים בטמפרטורה שונה למטרות ניסוי, המידות לבצע גם בטמפרטורה זו. בזמן ניתוח סביר יבוצעו בטמפרטורת החדר, אם וזמינותו ייערך בטמפרטורה שונה, המוח מצופה ומאופק צריך להיות מודגרות בטמפרטורה נדרש למשך 15 דקות לפני הפעלת וזמינותו. לבסוף, התבוננות וזמינותו שלאחר וולס הוא קריטי כדי לקבוע אם הרקמה מיצוב יושפע המדידות. לעיתים, יהיה אחד חריג חשוד טעות טוב זה, לאחר התבוננות את הצלחת תחת המיקרוסקופ ויבתר, ניתן לסלק מניתוח הנתונים עקב או אובדן של רקמת או mispositioning, שבו המוח חמק מתוך המרכז של הבאר, תקוע תחת הטבעת פולימר של הריסון. רקמות ייתכן שיאבדו אם הריסון לא אובטח כראוי אל הבאר היה מופרע במהלך מחזורי ערבוב. בעוד אף אחד האירועים הללו קורה לעתים קרובות, אם הם לא נכללים הניתוח, הם תפחית את ערכי קצב באופן משמעותי.
מידת השטף מטבולית כל רקמות על ידי ניטור צריכת החמצן ואת acidification חוץ-תאית מספק שיטה ביולוגית רלוונטיים להבנת איך חילוף החומרים משתנה על ידי הנוף גנטי או תנאים אחרים ניסיוני. שיטה זו היא רגישה מספיק כדי לזהות שינויים מטבוליים יחיד melanogaster ד המוח, אשר אינה אפשרית באמצעות עצירה-flow respirometry או calorimetry עקיף. זה גם פחות טכנית מאתגר יותר באמצעות אלקטרודה של קלארק כדי למדוד את צריכת החמצן. יתרון נוסף של פרוטוקול זה הוא היכולת לנתח את המוח כל אחד לכל טוב. התבנית 96-ובכן מאפשר קריאות יותר רגיש, לכן, גנוטיפ אחד או יותר יכול להיות לבדיקה במועד עקב מספר קטן של דוגמאות הנדרש לכל assay. בזמן מדידת מטבוליזם ברקמות הוא עדיין מאתגר ודורש בקפידה גדלו ובעלי מסונכרן, פרוטוקול זה מתאר שיטה פשטנית יחסית מהר, יש הפוטנציאל לנתח רגישויות מטבוליים רבים ד melanogaster המוח זחל ומבוגרים.
The authors have nothing to disclose.
מניות שהושגו מהמרכז בלומינגטון דרוזופילה מניות (NIH P40OD018637) נעשה שימוש במחקר זה. המחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי רשת הפיתוח מוסדיים פרס (מושג) למצוינות במחקר ביו-רפואי מן הלאומית המכון כללי רפואי למדעים של מכוני הבריאות הלאומיים תחת גרנט מספר P20GM103430, ועל ידי קרן רוד איילנד. מחברים תודה ווטרס ג’ עמ’ Snodgrass-חגורה לתמיכה שלהם בפיתוח פרוטוקול זה.
Assay medium | Agilent | 102365-100 | |
Calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive | Sigma Aldrich | DLW354240 | |
delrin | Grainger | 2XMK6 | |
Drosophila Schneider Media | Thermo Fisher | 21720-024 | |
Dumont High Precision Tweezers (style 5) | Ted Pella | 5622 | |
Loctite 409 | Amazon | ||
Mitostress kit | Agilent | 103015-100 | oligomycin, rotenone, and antimycin A included |
Netwell inserts (6-well) | VWR | 29442-136 | |
nylon mesh | Component Supply | U-CMN-64 | |
Parafilm M wrapping film | Fisher Scientific | S37440 | |
PYREX spot plate | Fisher Scientific | 13-748B | |
Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
Wave v2.4 XFe96 analyzer software | Agilent | https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop | free download to mac or windows |
XFe96 catridge and cell plates | Agilent | 102416-100 |