Sequenciamento proviral individual completo (aletas) fornece um método eficiente e de alta produtividade para a amplificação e sequenciamento de single, perto de provírus completos de HIV-1 (intactos e com defeito) e permite a determinação do seu potencial replicação-competência. FLIPS supera as limitações dos ensaios anteriores projetados para sequenciar o reservatório latente do HIV-1.
O ensaio completo Individual Proviral sequenciamento (aletas) é um método eficiente e de alta produtividade, projetado para amplificar e sequência única, perto de provírus de HIV-1 (intactas e defeituosos), longa-metragem. FLIPS permite a determinação da composição genética do HIV-1 integrado dentro de uma população celular. Através da identificação de defeitos em sequências proviral de VIH-1 que surgem durante a transcrição reversa, tais como grandes exclusões internas, códons de parada deletérios/hipermutação, mutações frameshift e mutações/exclusões em cis agindo elementos necessários para a maturação do virion, FLIPS podem identificar provírus integrados incapazes de replicação. O ensaio de FLIPS pode ser utilizado para identificar o provírus HIV-1 que faltam esses defeitos e são, portanto, potencialmente competentes de replicação. O protocolo de FLIPS envolve: lise das células infectadas de HIV-1, aninhados PCR de perto completos provírus HIV-1 (usando as primeiras demão direcionadas para o HIV-1 5′ e 3′ LTR), purificação de DNA e quantificação, preparação de biblioteca para geração de sequenciamento (NGS), NGS, de novo montagem de contigs proviral e um simples processo de eliminação para a identificação de provírus replicação competente. FLIPS fornece vantagens sobre os tradicionais métodos destinados a sequência integrada provírus HIV-1, tais como sequenciamento single-proviral. FLIPS amplifica e sequências perto de provírus completos, habilitando a competência de replicação ser determinada e também usa menos iniciadores de amplificação, impedindo que as consequências da primeira demão incompatibilidades. ALETAS é uma ferramenta útil para a compreensão da paisagem genética de provírus integrados do HIV-1, especialmente dentro do reservatório latente, no entanto, sua utilização pode estender para qualquer aplicação em que a composição genética do HIV-1 integrado é necessária.
Caracterização genética do HIV-1 reservatório latente, que persiste em indivíduos em longo prazo terapia antiretroviral (arte), tem sido vital para a compreensão de que a maioria de provírus integrados está com defeito e replicação-incompetente1 , 2. durante o processo de transcrição reversa, erros são introduzidos na sequência proviral integrado. Alguns mecanismos que geram sequências proviral defeituosas incluem o propenso de enzima transcriptase reversa HIV-13, modelo4, e/ou induzida por APOBEC Hipermutação5,6de comutação. Dois estudos recentes descobriram que aproximadamente 5% dos HIV-1 provírus isoladas de indivíduos na arte a longo prazo são geneticamente intacta e potencialmente replicação competente e pode contribuir para a recuperação rápida em níveis do plasma HIV-1 após a cessação da arte 1 , 2 , 7. estudos anteriores identificaram que provírus replicação do HIV-1 persistem no ingênuo e descansando memória CD4+ T célula subconjuntos (incluindo o central, transição e células de memória T efetoras), indicando a importância da visando estas células no futuro estratégias de erradicação a2,8,9.
Primeiros insights sobre a distribuição, a dinâmica e a manutenção do reservatório de latente do HIV-1 foram alcançados por meio da utilização de métodos de sequenciamento single-proviral (SPS) que caracterizam geneticamente genômica sub regiões do genoma do HIV-1,10 ,11,12,13. SPS é uma ferramenta versátil, capaz de sequenciar um único pró-vírus de HIV-1 de dentro de uma única célula infectada. No entanto, o SPS é incapaz de determinar a competência de replicação de provírus, desde que apenas sequências subgenômica provírus regiões e misses que contêm grandes exclusões dentro de sítios de ligação da primeira demão. Um estudo anterior demonstrou que a SPS superestima o tamanho do reservatório de replicação por 13 – a 17 vezes por meio de sequenciamento seletivamente intacta regiões genômicas sub2.
Para resolver as limitações do SPS, Ho et al . 4 e Bruner et al . 1 desenvolvidos ensaios de sequência perto completos provírus HIV-1. Isto permitiu que a frequência de geneticamente intactas e potencialmente competentes para replicação, provírus HIV-1 em indivíduos na arte a longo prazo a fixar. Estes ensaios amplificado e sequenciados (através de Sanger sequenciamento) regiões subgenômica que então foram montadas para obter um pró-vírus de HIV-1 sequência do (intacta ou com defeito). Três limitações desta abordagem são: 1) a utilização de múltiplos primers sequenciamento aumenta o risco de inadvertidamente introduzir defeitos na sequência proviral, 2) cartilha incompatibilidades podem impedir a amplificação de provírus particulares e 3) muitas vezes o toda a sequência de proviral não pode ser resolvida devido à tecnicidade desses métodos.
Para superar as limitações existentes completos ensaios de sequenciamento proviral de HIV-1, desenvolvemos o Full –Lcomprimento eusubjugado Pmentos Sequencing (aletas) do ensaio. ALETAS é um sequenciamento de próxima geração (NGS)-ensaio baseado que amplifica e sequências perto de provírus completos de HIV-1 (intactas ou com defeito) de forma eficiente e de alta produtividade. FLIPS oferece vantagens em ensaios anteriores, como limitar o número de primers utilizados; Portanto, ela diminui a chance de primer incompatibilidades, que podem limitar a população de provírus capturaram ou involuntariamente apresentar defeitos em uma sequência viral. FLIPS é também menos tecnicamente desafiador do que ensaios anteriores e envolve 6 etapas principais: células de 1) lise de infectados de HIV-1, 2) amplificação de provírus de HIV-1 único através de PCR aninhado realizada em limitar a diluição utilizando primers específicos para o altamente conservadas HIV-1 5′ e 3′ U5 LTR região (figura 1A), 3) purificação e quantificação dos produtos amplificados, 4) preparação da biblioteca de provírus amplificados para NGS, 5) NGS e 6) montagem de novo de provírus sequenciadas para obter contigs de cada pró-vírus individuais.
Sequências geradas por FLIPS podem se submeter a um processo rigoroso de eliminação para identificar aqueles que são geneticamente intacta e potencialmente competentes de replicação (Figura 1)2. Provírus geneticamente intactas faltam todos os defeitos conhecidos que resultar na geração de pró-vírus uma replicação-incompetente. Estes defeitos incluem: sequências de inversão, grandes exclusões internas, códons de parada Hipermutação/deletérios, frameshifts ou mutações na 5′ embalagens maiores ou sinal splice local doador (MSD).
Figura 1: passos críticos no ensaio de sequenciamento proviral individuais completos (aletas). (A) genoma de DNA do HIV-1 com sítios de ligação cartilha em 5′ e 3′ regiões LTR U5 usados por FLIPS para amplificar perto completos (com defeito e intactos) provírus HIV-1 através de PCR aninhado. (B) o Layout de uma placa PCR de 96 poços contendo 80 poços de amostra (20 poços para cada diluição), 4 poços de controlo negativo e 1 controle positivo bem. (C) processo de eliminação, usado para identificar geneticamente intactas e potencialmente competentes para replicação, provírus HIV-1. Esta figura foi modificada de Hiener et al . 2 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O ensaio de FLIPS é um método eficiente e de alta produtividade para amplificar e single de sequenciamento, perto de longa-metragem provírus HIV-1. Múltiplos fatores e passos críticos no protocolo que influenciam o número e a qualidade das sequências obtidas foram identificados. Em primeiro lugar, o número de células e a frequência de infecção do HIV-1 da população celular influenciaram o número de provírus amplificado. Por exemplo, em uma publicação anterior, aproximadamente metade como muitas sequências foram obtidas com o mesmo número de ingênuo CD4+ T células comparadas a memória efetoras CD4+ T células. Isto é porque ingênuo células geralmente têm uma menor frequência de infecção do que de células efetoras memória2. Em segundo lugar, a lise celular é preferível métodos baseados em colunas de extração para obtenção de DNA genômico como não há nenhum risco de perder o DNA no processo de extração. Por último, tal como acontece com qualquer ensaio baseados em PCR, evitando a contaminação é crítico. Separadas de áreas limpas devem ser designadas para a preparação de misturas de mestre, manipulação de DNA genômico, adicionando controles positivos, purificação de DNA e quantificação e preparação de biblioteca. Isto é particularmente importante para os ensaios de cópia única como a apresentada aqui.
Implementação do ensaio FLIPS primeiro deve incluir executando um controle positivo como plasmídeos pNL4-3, ao invés de amostras de participantes. Isso permitirá que qualquer prévia de solução de problemas para o uso de células positivas do HIV-1, como as sequências obtidas podem ser comparadas com sequências de referência disponível para estes plasmídeos. Ao usar células de HIV-1 positivas, é importante considerar o subtipo do HIV-1 (primeiras demão projetados para FLIPS são específicas para o subtipo B) e a frequência de infecção da população celular, se pouco ou nenhum provírus é amplificado. Sequências da primeira demão podem ser modificado/redesenhado para combinar com outros subtipos. Além disso, um bem que contém um controle positivo deve ser incluído em cada PCR realizado.
FLIPS tem de superar as limitações dos ensaios anteriores de sequenciamento, incluindo SPS. Através de amplificação e sequenciamento perto completos provírus HIV-1, FLIPS podem determinar a potencial replicação-competência de provírus HIV-1. Isto não era possível usar SPS, que sequenciado somente regiões subgenômica e, portanto, selecionados para sequências com sítios de ligação intacta da primeira demão. Além disso, FLIPS supera as limitações associadas utilizando múltiplos amplificação e sequenciamento primers, como foi empregado por sequenciamento completos anteriores ensaios1,4. Através de duas rodadas de PCR, visando as regiões de HIV-1 LTR combinadas com NGS, FLIPS diminui o número e a complexidade das primeiras demão necessária. ALETAS é, portanto, menos suscetível às consequências da primeira demão incompatibilidades, ou seja, a identificação errônea de provírus defeituosos e uma incapacidade para amplificar um provírus dentro de uma população. O protocolo de FLIPS também é mais eficiente e permite um maior rendimento de sequenciamento do que métodos anteriores.
Evidentemente, FLIPS fornece vantagens sobre os métodos existentes que determinam a composição genética de provírus HIV-1. No entanto, é importante reconhecer as limitações de FLIPS. Em primeiro lugar, o ensaio de FLIPS não foi desenvolvido como uma ferramenta para medir o tamanho do reservatório latente HIV-1, como análises para determinar se a FLIPS amplifica todos os presentes em uma população celular de pró-vírus HIV-1 não foram concluídas. ALETAS em vez disso é útil para fazer comparações relativas da composição do reservatório entre populações de célula diferente2. Em segundo lugar, a replicação-competência da intactas provírus HIV-1 não pode ser determinada com certeza na vivo de análise, como aquelas realizadas por Ho et al . 4. em terceiro lugar, FLIPS não foi concebido para determinar o local de integração de provírus HIV-1.
Pequenas variações no protocolo FLIPS podem aumentar a sua aplicação. Por exemplo, mudanças na primeira demão sequências podem permitir diferentes e vários subtipos de HIV-1 para ser amplificado e sequenciados. Sequenciamento dos virions do plasma HIV-1 é possível através da adição de síntese do cDNA antes da PCR aninhado. Futura utilização de métodos de sequenciamento de molécula vai eliminar a necessidade de montagem de novo .
Sequenciamento genético de provírus integrados do HIV-1 tem aumentado nossa compreensão do reservatório latente do HIV-1. ALETAS é uma importante ferramenta para estudos futuros, elucidar a composição e a distribuição do reservatório latente. No entanto, a aplicação de FLIPS pode estender além do reservatório. Estudos futuros podem utilizar FLIPS para determinar objectivos específicos para tecnologia CRISPR-Cas, ou auxiliar na identificação de codificação e regiões não-codificantes que tornar o vírus mais responsivos a latência invertendo os agentes. Recombinação viral pode ser melhor entendida por olhar para os locais de junção de grandes exclusões internas.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado o Delaney AIDS Research Enterprise (DARE) para encontrar uma cura (1U19AI096109 e 1UM1AI126611-01); um amfAR Research Consortium na erradicação do HIV (ARCHE) Collaborative Research Grant de The Foundation for AIDS Research (amfAR 108074-50-RGRL); Centro Australiano para HIV e hepatite Virology Research (ACH2); UCSF-GIVI Center for AIDS Research (P30 AI027763); e o australiano nacionais de saúde e Conselho de pesquisa médica (AAP1061681). Gostaríamos de agradecer o Dr. Joey Lai, genómica Facility Manager no Instituto de pesquisa médica para a sua formação na biblioteca preparação e utilização de suas instalações de Westmead e o centro de Ramaciotti para a genómica (Universidade de New South Wales, Sydney, Austrália) para a realização de sequenciamento. Reconhecemos com gratidão os participantes que doou as amostras para este estudo.
UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0 | Invitrogen | 15568025 | Dilute to 5 mM for nested PCR |
Nonidet P 40 Substitute solution | Sigma | 98379 | |
Tween-20 | Sigma | P9416 | |
Proteinase K Solution (20 mg/mL) | Promega | AM2548 | |
96 well thermocycler | Any 96 well thermocycler can be used | ||
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
10X High Fidelity Buffer [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4] | Invitrogen | 11304011 | |
50 mM MgSO4 | Invitrogen | 11304011 | |
PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | C1141 | |
Ultrapure H2O | Invitrogen | 10977023 | |
PCR1 and PCR2 Primers | Desalted. Dilute to (100 M) with H2O | ||
PCR Plate 96 Well, Half Skirt, Single Notch Corner, Clear | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
Microseal 'B' Adhesive Seals | BioRad | MSB1001 | Required to seal 96 well PCR plates |
HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) | The following reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) from Dr. Malcolm Martin (Cat# 114). | Diluted to 10^5 copies/mL and used as positive control | |
PCR plate spinner or benchtop centrifuge | |||
E-GEL 48 1% Agarose | Invitrogen | G800801 | Precast 1% agarose gels (two gels used per 96 well plate). Any 1% agarose gel can be substituted. Contains ethidium bromide. |
DirectLoad Wide Range DNA Marker | Sigma | D7058 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
Mother E-Base device | Invitrogen | EBM03 | Required for running precast 48 well 1% agarose gels |
Gel Doc EZ Gel Documentation System | BioRad | 1708270 | Any visualisation system for ethidium bromide containing agarose gels can be used |
PlateMax Peelable Heat Sealing | Axygen | HS-200 | Heat sealing film for long term storage |
96 Well 0.8 mL Storage Plate | ThermoFisher Scientific | AB0765 | 0.8 mL 96 well plate required for magnetic bead based PCR purification |
Agencourt AMPure XP (PCR purification kit) | Beckman Coulter | A63880 | Magnetic bead based PCR purification kit. Other PCR purification kits can be substitued here (e.g. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Cat#28106) |
Ethyl alcohol, Pure. 200 proof, for molecular biology | Sigma | E7023 | |
Magnetic Stand-96 | Invitrogen | AM10027 | |
Microplate shaker | Optional | ||
Buffer EB | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P11496 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
Microplate reader | |||
Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-2001 | |
Hard-Shell 96-Well PCR Plates | Biorad | HSP9601 | Required for Nextera XT DNA library preparation kit |
Library Quantification Kit – Illumina/Universal | Kapa Biosystems | KK4824 | Other library quantification kits can be substitued (e.g. JetSeq DNA Library Quantification Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029) |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technology | Automated electrophoresis system . Use in conjunction with a High Sensistivity DNA kit | |
High Sensistivty DNA kit | Agilent Technology | 5067-4626 | |
Illumina MiSeq Platform | Illumina |