勉強リボヌクレオチド定款: 酵母ゲノムとリボヌクレオチド誘発突然変異を測定のリボヌクレオチド鎖特異的検出
Summary
リボヌクレオチドは真核生物の核 DNA 複製時にゲノムに組み込む最も豊富な非正規のヌクレオチドです。正しくない削除、DNA 損傷と突然変異誘発リボヌクレオチドが発生します。リボヌクレオチド混入 DNA とその変異原性効果の豊かさを評価するために使用される 2 つの実験的アプローチを紹介します。
Abstract
核 DNA のリボヌクレオチドの存在は、ゲノム不安定性の源であると示されています。リボヌクレオチド定款のエクステントがアルカリ加水分解によって評価される、電気泳動のゲルの RNA は非常にアルカリ条件で加水分解しやすい。これは、南しみ分析との組み合わせで使用できます場所を決定し、リボヌクレオチドが組み込まれてに鎖。ただし、この手順は半定量的のみと感度は向上しますがアンチセンス サザンブロット プロービングにリボヌクレオチド コンテンツの小さな変化を検出する十分な区別できない場合があります。DNA のリボヌクレオチドの最も顕著な生物学的影響の 1 つとしては、前進突然変異試験を使用して自然発生突然変異を分析できます。適切なレポーター遺伝子を使用すると、選択した、全体的な機能の喪失の結果まれな突然変異ができるし、レポーターの遺伝子の DNA 塩基配列と変動実験からのデータを組み合わせることで特定の突然変異率を測定できます。変動アッセイは、さまざまな特定の遺伝的背景や成長条件で変異原性のプロセスを調べるに適用されます。
Introduction
真核生物の核 DNA の複製時に、リボヌクレオチドはすべての 3 つの主要な DNA replicases、DNA ポリメラーゼ (政治家) α、ε、δ1、2ゲノムに組み込まれます。RNase H2 依存リボヌクレオチド切除修理 (RER3) は、これらの組み込みのリボヌクレオチドの大半を削除します。
糖の水酸基 2′ 2′ 3′ 環状リン酸や 5′-オハイオ州4と他の 1 つの端を解放、隣接のリン酸ジエステル結合を攻撃できる DNA のリボヌクレオチドは、加水分解を受けやすい。アルカリ条件大幅にこの反応を加速することができます。したがって、基本的なソリューションで潜伏中に埋め込まれたリボヌクレオチドの加水分解アルカリ アガロース電気泳動5で目視できるゲノム DNA の断片化が発生します。この DNA を膜に転送およびアルカリに敏感なサイトに、新生リード- またはラギング鎖の DNA を組み込むリボヌクレオチドによって引き起こされるを識別できるように特異的プローブを用いたサザンブロット解析によって検出できます。それぞれ。
酵母細胞 H2 RNase 活性、トポイソメラーゼ (Top1) 私は埋め込みリボヌクレオチド6,7で DNA をニックスするときリボヌクレオチドの除去を開始できます。ただし、Top1 は、リボヌクレオチドの 3′ 側に切断、これは 5′-オハイオ州と桿菌に難治性 2′ 3′ 環状リン酸の DNA 終了を生成します。修理、またはこれらの ‘汚れた部分’ の異常処理に失敗はゲノム不安定性につながることができます。さらに、切開繰り返し DNA シーケンス内で発生すると、修復処理は欠失変異体につながります。タンデムリピートのため、これは特に問題となる、削除に短い (の 2 つおよび 5 つの塩基対の間) が一般的に RNase H2 欠損細胞で観察されます。酵母リボヌクレオチド体用新生リーディング鎖合成中に無差別 DNA ポリメラーゼ ε 変異 (pol2 M644G) の活動によって悪化させる RNase H2 の不在で Top1 依存への有害な影響。
自発の突然変異につながる DNA のリボヌクレオチドの処理と適切なレポーター遺伝子を使用し、付属の形質転換の選択でこの変異を検出できます。変動試験やルリアと Delbrück の実験は、選択可能なレポーター遺伝子8,9を使用して突然変異率を測定する最も一般的な方法の 1 つです。酵母、 URA3とCAN1遺伝子は、遺伝子の機能が失われるすべての突然変異型の検出を可能にする前進突然変異試験で記者として使えます。突然変異率はターゲットのレポーターの遺伝子の変異のないシングル コロニーから始まった複数並列文化の観察中央値として。RNase H2 欠損株rnh201Δ はタンデムで 2-5 bp 削除の発現率が上昇によって引き起こされる主穏やかに上昇の全体的な突然変異率などの酵母は、シーケンスを繰り返します。したがって、リボヌクレオチドのゲノムの変異原性の効果を完全に特徴づける、特定の突然変異率を決定する必要があります。この場合は、 URA3またはCAN1のレポーター遺伝子を増幅し、シーケンスの種類と、突然変異の場所を決定することができます、特定の突然変異率を算出することができます。複数の独立したURA3またはCAN1変異体の突然変異をコンパイルは、突然変異スペクトルを生成する使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、2 組の DNA 複製と未修理リボヌクレオチドの変異原性の効果の中に組み込まれてリボヌクレオチドを半定量的に解析は、頻繁に実験のためのプロトコルについて述べる。ただし、これらのアプローチは、モデルが出芽酵母を真核生物を含む、他の微生物とさらに高い真核生物にこれらの技術を簡単に適合できます。
南しみが付くことと相まってアルカリ …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 は自分の仕事のすべての現在および元クンケル研究室メンバーに感謝と議論のプロトコルに関連して今回発表されたデータを再利用します。この作品は、国立衛生研究所 (NIH)、国立環境衛生研究所 (NIEHS) の学内研究部門から T.A.K. にプロジェクト Z01 ES065070 によって支えられました。
Materials
| YPD media | 20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H2O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave. | ||
| COM plates | 1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H2O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 – 35 ml per plate. | ||
| CAN plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 56 °C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution. | ||
| 5-FOA plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 60 °C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution. | ||
| L-Canavanine sulfate | US Biological | C1050 | |
| 5-FOA | US Biological | F5050 | |
| 20 mL glass culture tube | Any brand | ||
| Culture rotator in 30 °C incubator | Shaker incubator can be used instead | ||
| 96 well round bottom plates | Sterile, any brand | ||
| 3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Autoclave before use |
| 12-channel pipettes | Any brand | ||
| Ex Taq DNA Polymerase | TaKaRa | RR001 | |
| Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit | Epicenter | MPY80200 | |
| 3 M sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| 100% ethanol | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | Newer model available |
| dsDNA BR Assay kit | Invitrogen | Q32850 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Ficoll 400 | Dot Scientific Inc. | DSF10400 | |
| Bromocresol green | Eastman | 6356 | |
| Xylene cyanol FF | International Technologies Inc. | 72120 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.0) | Teknova | T5080 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | |
| UV transilluminator | |||
| Amersham Nylon membrane Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN303B | |
| 3 MM CHR Chromotography paper | Whatman | 3030-392 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| G-25 spin column | GE Healthcare | 27-5325-01 | |
| 1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2) | Sigma-Aldrich | NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390) |
|
| SDS | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671 | |
| Geiger counter |
References
- Joyce, C. M. Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 94 (5), 1619-1622 (1997).
- Nick McElhinny, S. A., et al. Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (11), 4949-4954 (2010).
- Sparks, J. L., et al. RNase H2-initiated ribonucleotide excision repair. Molecular Cell. 47 (6), 980-986 (2012).
- Li, Y., Breaker, R. R. Kinetics of RNA Degradation by Specific Base Catalysis of Transesterification Involving the 2′-Hydroxyl Group. Journal of the American Chemical Society. 121 (23), 5364-5372 (1999).
- Nick McElhinny, S. A., et al. Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA. Nature Chemical Biology. 6 (10), 774-781 (2010).
- Williams, J. S., Kunkel, T. A. Ribonucleotides in DNA: origins, repair and consequences. DNA Repair (Amst). 19, 27-37 (2014).
- Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (6), 350-363 (2016).
- Jones, M. E., Thomas, S. M., Rogers, A. Luria-Delbruck fluctuation experiments: design and analysis. Génétique. 136 (3), 1209-1216 (1994).
- Zheng, Q. A new practical guide to the Luria-Delbruck protocol. Mutat Research. 781, 7-13 (2015).
- Sambrook, J. . Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (2001).
- Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. The major roles of DNA polymerases epsilon and delta at the eukaryotic replication fork are evolutionarily conserved. PLoS Genetics. 7 (12), e1002407 (2011).
- Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. Ribonucleotides are signals for mismatch repair of leading-strand replication errors. Molecular Cell. 50 (3), 437-443 (2013).
- Williams, J. S., et al. Topoisomerase 1-mediated removal of ribonucleotides from nascent leading-strand DNA. Molecular Cell. 49 (5), 1010-1015 (2013).
- Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 185-191 (2015).
- Foster, P. L. Methods for determining spontaneous mutation rates. Methods Enzymology. 409, 195-213 (2006).
- Williams, J. S., et al. Evidence that processing of ribonucleotides in DNA by topoisomerase 1 is leading-strand specific. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (4), 291-297 (2015).
- Pavlov, Y. I., Shcherbakova, P. V., Kunkel, T. A. In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta. Génétique. 159 (1), 47-64 (2001).
- Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).
- Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon. DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).
- Lujan, S. A., et al. Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity. PLoS Genetics. 8 (10), e1003016 (2012).
- Reijns, M. A., et al. Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development. Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).
- Lujan, S. A., et al. Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition. Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).
