دراسة Ribonucleotide التأسيس: كشف حبلا على حدة Ribonucleotides في جينوم الخميرة وقياس الطفرات المستحثة Ribonucleotide
Summary
ريبونوكليوتيديس من بين النيوكليوتيدات غير المقبول الأكثر وفرة دمج الجينوم أثناء النسخ المتماثل حقيقية النواة للحمض النووي. إذا تمت إزالة بشكل غير صحيح، يمكن أن يسبب ريبونوكليوتيديس تلف الحمض النووي والطفرات. نقدم هنا، نهجين التجريبية التي تستخدم لتقييم وفرة إدماج ريبونوكليوتيدي في الحمض النووي وآثاره مطفرة.
Abstract
ثبت وجود ريبونوكليوتيديس في الحمض النووي يكون مصدرا لعدم الاستقرار المجيني. مدى إدماج ribonucleotide يمكن تقييمها بالتحلل المائي القلوي وجل التفريد كما الجيش الملكي النيبالي عرضه للتحلل في الظروف القلوية. هذا، بالاقتران مع تحليل لطخة جنوب استخدامها لتحديد الموقع وحبلا إلى التي أدرجت في ريبونوكليوتيديس. ومع ذلك، هذا الإجراء هو فقط نصف الكمية، وقد لا تكون حساسة بما يكفي للكشف عن تغيرات صغيرة في المحتوى ريبونوكليوتيدي، على الرغم من أن السبر حبلا على حدة الجنوبي وصمة عار ويحسن الحساسية. كمقياس لإحدى العواقب البيولوجية الأكثر لفتا للنظر من ريبونوكليوتيديس في الحمض النووي، يمكن تحليل الطفرات العفوية باستخدام مقايسة طفرة إلى الأمام. استخدام الجينات مراسل المناسبة، يمكن أن تكون الطفرات النادرة التي ينتج عنها فقدان الوظيفة المحددة والشاملة، ويمكن قياس معدلات الطفرة محدد عن طريق الجمع بين البيانات المستمدة من تجارب تقلب مع تسلسل الحمض النووي الجينات مراسل. والرزن تقلب قابل للتطبيق لدراسة طائفة واسعة من العمليات مطفرة في خلفية وراثية محددة أو ظروف النمو.
Introduction
أثناء النسخ المتماثل التوكسينات الحمض النووي، تدمج ribonucleotides الجينوم بجميع الثلاثة الرئيسية ريبليكاسيس الحمض النووي والحمض النووي α بولمرس (Pols) واليورو و δ1،2. رناسي تعتمد على H2 ribonucleotide الختان إصلاح (RER3) يزيل معظم هذه ريبونوكليوتيديس المضمنة.
ريبونوكليوتيدي في الحمض النووي عرضه للتحلل المائي، كما يمكن مهاجمة مجموعة الهيدروكسيل 2 ‘لمجموعة السكر بوند phosphodiester المتاخمة، الإفراج عن نهاية واحدة مع فوسفات دوري 2’-3 ‘والآخر مع 5’–أوه4. ويمكن تسريع ظروف قلوية كثيرا رد الفعل هذا. وهكذا، يسبب التحلل المائي ل ribonucleotides المضمنة أثناء حضانة في حل أساسي تجزؤ الحمض النووي، التي يمكن تصور ب التفريد قلوية [اغروس]5. هذا الحمض النووي يمكن أن تنقل إلى غشاء وسبر بتحليل لطخة الجنوبية استخدام المسابير حبلا الخاصة التي تسمح بتحديد مواقع حساسة القلوية الناجمة عن ريبونوكليوتيديس تدرج إلى الوليدة الرائدة-أو متخلفة-حبلا الحمض النووي، على التوالي.
في خلايا الخميرة التي تفتقر إلى النشاط H2 رناسي، يمكن البدء في إزالة ريبونوكليوتيديس عند توبويسوميراسي (Top1) أنا نيكس الحمض النووي في6،ريبونوكليوتيدي المضمنة7. ومع ذلك، عندما كليفس Top1 على الجانب 3 ‘ريبونوكليوتيدي، هذا يولد 5’–يا و 2 ‘-3’ الفوسفات دوري الحمض النووي الغايات التي مقاومة للحرارة إلى ريليجيشن. عدم إصلاح، أو تجهيز الشاذة هذه ‘الغايات القذرة’ يمكن أن يؤدي إلى عدم الاستقرار المجيني. وبالإضافة إلى ذلك، في حالة حدوث الشق داخل تكرار تسلسل الحمض النووي، عملية الإصلاح يمكن أن يؤدي إلى طفرات الحذف. وهذه مشكلة خاصة ليكرر جنبا إلى جنب، حيث القصير الحذف (من بين اثنين وخمسة أزواج قاعدة) عادة ولوحظت في الخلايا رناسي H2-تعاني من نقص. Top1-تعتمد على الآثار الضارة في غياب الخميرة H2 رناسي النشاط تتفاقم في دنا بوليميريز اليورو متحولة (pol2-M644G) منحل لإدماج ribonucleotide خلال توليف حبلا الرائدة الوليدة.
تجهيز ريبونوكليوتيديس في الحمض النووي يؤدي إلى الطفرات العفوية ويمكن الكشف عن هذه الطفرات باستخدام الجينات مراسل المناسبة وتحديد التغيير المظهرية المصاحبة لها. تقلب اختبار أو تجربة لوريا وديلبروك واحد من الأساليب الأكثر شيوعاً لقياس معدلات الطفرة التلقائية باستخدام التحديد مراسل الجينات8،9. في الخميرة، يمكن استخدام الجينات URA3 و CAN1 كالصحافيين مقايسة طفرة إلى الأمام، مما يسمح للكشف عن جميع أنواع الطفرات التي تؤدي إلى فقدان وظيفة الجينات. ويقدر معدل الطفرات العفوية كوسيط التي لاحظت لثقافات متعددة موازية بدأت من المستعمرات مفردة دون الطفرات في الجينات مراسل الهدف. خميرة سلالة رناسي H2 التي تفتقر إلى مثل rnh201Δ له بمعدل الطفرات عفوية وعموما متوسطة مرتفعة إلى حد كبير بسبب ارتفاع معدل انتشار الإصابة 2-5 bp الحذف بالترادف تكرار تسلسل. وهكذا تماما وصف تأثيرات مطفرة ريبونوكليوتيديس في الجينوم، معدلات طفرة محددة تحتاج إلى تحديد. وفي هذه الحالة، يمكن تضخيم الجينات مراسل URA3 أو CAN1 ومتسلسلة لتحديد أنواع وأماكن للطفرات، ويمكن حساب معدلات الطفرة محددة. تجميع الطفرات التي تم تحديدها في عدة طفرات مستقلة URA3 أو CAN1 ثم استخدامها لتوليد طيف الطفرات.
Protocol
Representative Results
Discussion
وهنا يصف لنا البروتوكولات لمجموعتين من التجارب التي تستخدم بشكل متكرر لتحليل شبه كمي ribonucleotides إدراجها أثناء النسخ المتماثل للحمض النووي وآثار مطفرة ريبونوكليوتيديس التي لم يتم إصلاحها. على الرغم من أن تنطوي هذه النهج النموذجي eukaryote S. cerevisiae، يمكن تكييفها هذه التقنيات بسهولة للميكروب…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر جميع الأعضاء الحاليين والسابقين في مختبر كونكيل لعملهم والمناقشات ذات الصلة بالبروتوكول، وإعادة استخدام البيانات المقدمة هنا. وأيد هذا العمل المشروع Z01 ES065070 إلى T.A.K. من “شعبة البحوث الداخلية” للمعاهد الوطنية للصحة (المعاهد الوطنية للصحة)، “الوطني معهد لعلوم الصحة البيئية” (نيس).
Materials
| YPD media | 20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H2O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave. | ||
| COM plates | 1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H2O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 – 35 ml per plate. | ||
| CAN plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 56 °C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution. | ||
| 5-FOA plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 60 °C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution. | ||
| L-Canavanine sulfate | US Biological | C1050 | |
| 5-FOA | US Biological | F5050 | |
| 20 mL glass culture tube | Any brand | ||
| Culture rotator in 30 °C incubator | Shaker incubator can be used instead | ||
| 96 well round bottom plates | Sterile, any brand | ||
| 3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Autoclave before use |
| 12-channel pipettes | Any brand | ||
| Ex Taq DNA Polymerase | TaKaRa | RR001 | |
| Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit | Epicenter | MPY80200 | |
| 3 M sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| 100% ethanol | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | Newer model available |
| dsDNA BR Assay kit | Invitrogen | Q32850 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Ficoll 400 | Dot Scientific Inc. | DSF10400 | |
| Bromocresol green | Eastman | 6356 | |
| Xylene cyanol FF | International Technologies Inc. | 72120 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.0) | Teknova | T5080 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | |
| UV transilluminator | |||
| Amersham Nylon membrane Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN303B | |
| 3 MM CHR Chromotography paper | Whatman | 3030-392 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| G-25 spin column | GE Healthcare | 27-5325-01 | |
| 1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2) | Sigma-Aldrich | NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390) |
|
| SDS | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671 | |
| Geiger counter |
References
- Joyce, C. M. Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 94 (5), 1619-1622 (1997).
- Nick McElhinny, S. A., et al. Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (11), 4949-4954 (2010).
- Sparks, J. L., et al. RNase H2-initiated ribonucleotide excision repair. Molecular Cell. 47 (6), 980-986 (2012).
- Li, Y., Breaker, R. R. Kinetics of RNA Degradation by Specific Base Catalysis of Transesterification Involving the 2′-Hydroxyl Group. Journal of the American Chemical Society. 121 (23), 5364-5372 (1999).
- Nick McElhinny, S. A., et al. Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA. Nature Chemical Biology. 6 (10), 774-781 (2010).
- Williams, J. S., Kunkel, T. A. Ribonucleotides in DNA: origins, repair and consequences. DNA Repair (Amst). 19, 27-37 (2014).
- Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (6), 350-363 (2016).
- Jones, M. E., Thomas, S. M., Rogers, A. Luria-Delbruck fluctuation experiments: design and analysis. Génétique. 136 (3), 1209-1216 (1994).
- Zheng, Q. A new practical guide to the Luria-Delbruck protocol. Mutat Research. 781, 7-13 (2015).
- Sambrook, J. . Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (2001).
- Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. The major roles of DNA polymerases epsilon and delta at the eukaryotic replication fork are evolutionarily conserved. PLoS Genetics. 7 (12), e1002407 (2011).
- Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. Ribonucleotides are signals for mismatch repair of leading-strand replication errors. Molecular Cell. 50 (3), 437-443 (2013).
- Williams, J. S., et al. Topoisomerase 1-mediated removal of ribonucleotides from nascent leading-strand DNA. Molecular Cell. 49 (5), 1010-1015 (2013).
- Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 185-191 (2015).
- Foster, P. L. Methods for determining spontaneous mutation rates. Methods Enzymology. 409, 195-213 (2006).
- Williams, J. S., et al. Evidence that processing of ribonucleotides in DNA by topoisomerase 1 is leading-strand specific. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (4), 291-297 (2015).
- Pavlov, Y. I., Shcherbakova, P. V., Kunkel, T. A. In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta. Génétique. 159 (1), 47-64 (2001).
- Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).
- Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon. DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).
- Lujan, S. A., et al. Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity. PLoS Genetics. 8 (10), e1003016 (2012).
- Reijns, M. A., et al. Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development. Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).
- Lujan, S. A., et al. Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition. Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).
