अध्ययन Ribonucleotide निगमन: किनारा-खमीर जीनोम में Ribonucleotides के विशिष्ट पता लगाने और Ribonucleotide प्रेरित Mutagenesis को मापने
Summary
Ribonucleotides सबसे प्रचुर मात्रा में गैर-विहित eukaryotic परमाणु डीएनए प्रतिकृति के दौरान जीनोम में शामिल न्यूक्लियोटाइड के बीच में हैं । अगर ठीक से नहीं निकाला गया तो ribonucleotides डीएनए को नुकसान और mutagenesis पैदा कर सकता है । यहां, हम दो प्रयोगात्मक दृष्टिकोण है कि डीएनए और उसके mutagenic प्रभाव में ribonucleotide निगमन की बहुतायत का आकलन किया जाता है प्रस्तुत करते हैं ।
Abstract
परमाणु डीएनए में ribonucleotides की मौजूदगी को जीनोमिक अस्थिरता का स्रोत दिखाया गया है. ribonucleotide की हद तक क्षारीय hydrolysis और जेल ट्रो द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है के रूप में आरएनए उच्च क्षारीय स्थितियों में hydrolysis के लिए अतिसंवेदनशील है । यह, दक्षिणी दाग विश्लेषण के साथ संयोजन में स्थान और किनारा जिसमें ribonucleotides शामिल किया गया है निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, यह प्रक्रिया केवल अर्द्ध मात्रात्मक है और ribonucleotide सामग्री में छोटे परिवर्तन का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील नहीं हो सकता है, हालांकि कतरा विशिष्ट दक्षिणी दाग जांच संवेदनशीलता में सुधार । डीएनए में ribonucleotides के सबसे हड़ताली जैविक परिणामों में से एक का एक उपाय के रूप में, सहज mutagenesis एक आगे उत्परिवर्तन परख का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है । उपयुक्त रिपोर्टर जीन का प्रयोग, दुर्लभ उत्परिवर्तनों कि समारोह के नुकसान में परिणाम और चयनित किया जा सकता समग्र और विशिष्ट उत्परिवर्तन दरों रिपोर्टर जीन के डीएनए अनुक्रमण के साथ उतार चढ़ाव प्रयोगों से डेटा के संयोजन से मापा जा सकता है । अस्थिरता परख के लिए विशिष्ट आनुवंशिक पृष्ठभूमि या विकास की स्थिति में mutagenic प्रक्रियाओं की एक विस्तृत विविधता की जांच लागू है ।
Introduction
eukaryotic परमाणु डीएनए प्रतिकृति के दौरान, ribonucleotides सभी तीन प्रमुख डीएनए प्रतिकृतियां, डीएनए polymerases (Pols) α, ε, और δ1,2द्वारा जीनोम में शामिल कर रहे हैं । RNase H2-आश्रित ribonucleotide आबकारी मरंमत (RER3) इन एंबेडेड ribonucleotides के बहुमत को हटा ।
डीएनए में एक ribonucleotide hydrolysis की संभावना है, के रूप में चीनी moiety के 2 ‘ हाइड्रॉक्सिल समूह आसंन phosphodiester बांड पर हमला कर सकते हैं, एक 2 ‘-3 चक्रीय फॉस्फेट के साथ एक छोर जारी है और एक के साथ दूसरे 5 ‘-ओह4। alkaline स्थितियों बहुत इस प्रतिक्रिया में तेजी लाने कर सकते हैं । इस प्रकार, एक बुनियादी समाधान में गर्मी के दौरान एंबेडेड ribonucleotides के hydrolysis जीनोमिक डीएनए के विखंडन का कारण बनता है, जो alkaline-agarose ट्रो5द्वारा visualized किया जा सकता है । यह डीएनए एक झिल्ली को हस्तांतरित किया जा सकता है और दक्षिणी ब्लाट विश्लेषण द्वारा जांच किनारा-विशिष्ट जांच है कि क्षार संवेदनशील नवजात अग्रणी-या विश्र्व-किनारा डीएनए में शामिल ribonucleotides की वजह से साइटों की पहचान की अनुमति का उपयोग कर, क्रमशः.
खमीर कोशिकाओं में कमी RNase H2 गतिविधि, ribonucleotides को हटाने शुरू किया जा सकता है जब चतुर्थ तोपोइसोमेरसे मैं (Top1) एंबेडेड ribonucleotide6,7पर डीएनए निक । हालांकि, जब Top1 ribonucleotide के 3 ‘ पक्ष पर सट जाता है, इस 5 ‘-OH और 2 ‘-3 ‘ चक्रीय फॉस्फेट डीएनए समाप्त होता है कि रेलिगेशन करने के लिए दुर्दम्य हैं उत्पन्न करता है. मरंमत करने में विफलता, या इन ‘ गंदे सिरों के ंयायपालिका प्रसंस्करण जीनोमिक अस्थिरता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसके अलावा, अगर चीरा एक दोहराने डीएनए अनुक्रम के भीतर होता है, मरम्मत की प्रक्रिया को हटाने उत्परिवर्तनों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. यह मिलकर दोहराया जाता है के लिए विशेष रूप से समस्याग्रस्त है, जहां छोटे विलोपन (के बीच दो और पांच आधार जोड़े) सामांयतः RNase H2-कमी कोशिकाओं में मनाया जाता है । खमीर RNase H2 गतिविधि के अभाव में Top1-निर्भर बचके प्रभाव एक डीएनए पोलीमरेज़ ε उत्परिवर्ती (pol2-M644G) नवजात प्रमुख किनारा संश्लेषण के दौरान ribonucleotide के लिए अनेक में ख़राब कर रहे हैं ।
डीएनए में ribonucleotides के प्रसंस्करण के लिए सहज उत्परिवर्तनों की ओर जाता है और इस mutagenesis उपयुक्त रिपोर्टर जीन का उपयोग करके और साथ phenotypic परिवर्तन के लिए चयन द्वारा पता लगाया जा सकता है । एक उतार-चढ़ाव परीक्षण या Luria और Delbrück प्रयोग सबसे अधिक इस्तेमाल किया तरीकों में से एक के लिए सहज उत्परिवर्तन चयन रिपोर्टर8,9जीन का उपयोग दरों को मापने है । खमीर में, URA3 और CAN1 जीन एक आगे उत्परिवर्तन परख, जो सभी उत्परिवर्तन प्रकार है कि जीन समारोह के नुकसान में परिणाम का पता लगाने के लिए अनुमति देता में संवाददाताओं के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । सहज उत्परिवर्तन दर है कि कई समानांतर संस्कृतियों के लिए मनाया के औसत के रूप में अनुमानित है लक्ष्य रिपोर्टर जीन में उत्परिवर्तनों के बिना एकल कालोनियों से शुरू कर दिया । rnh201Δ के रूप में एक खमीर RNase H2 की कमी तनाव एक मामूली ऊंचा समग्र सहज उत्परिवर्तन दर है कि काफी हद तक मिलकर दोहराने दृश्यों में 2-5 बीपी विलोपन के एक ऊंचा घटना के कारण होता है । इस प्रकार, पूरी तरह से जीनोम में ribonucleotides के mutagenic प्रभाव को चिह्नित करने के लिए, विशिष्ट उत्परिवर्तन दरों को निर्धारित किया जाना चाहिए । इस मामले में, URA3 या CAN1 रिपोर्टर जीन को परिलक्षित किया जा सकता है और उत्परिवर्तनों के प्रकार और स्थानों का निर्धारण करने के लिए अनुक्रम, और विशिष्ट उत्परिवर्तन दरों की गणना की जा सकती है । एकाधिक स्वतंत्र URA3 या CAN1 म्यूटेंट में पहचाने गए उत्परिवर्तनों का संकलन तो एक उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रम उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम उन प्रयोगों के दो सेट के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो अक्सर अर्द्ध-मात्रात्मक रूप से डीएनए प्रतिकृति और unrepaired ribonucleotides के mutagenic प्रभावों के दौरान शामिल ribonucleotides का विश्लेषण करते हैं. हालांकि इन तर?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अपने काम और प्रोटोकॉल से संबंधित चर्चा के लिए सभी वर्तमान और पूर्व Kunkel लैब के सदस्यों को धंयवाद और reused डेटा यहां प्रस्तुत किया । यह कार्य नेशनल इंस्टिट्यूट ऑफ हेल्थ (NIH), राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान (NIEHS) के अंदर अनुसंधान के प्रभाग से T.A.K. करने के लिए परियोजना Z01 ES065070 द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| YPD media | 20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H2O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave. | ||
| COM plates | 1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H2O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 – 35 ml per plate. | ||
| CAN plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 56 °C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution. | ||
| 5-FOA plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 60 °C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution. | ||
| L-Canavanine sulfate | US Biological | C1050 | |
| 5-FOA | US Biological | F5050 | |
| 20 mL glass culture tube | Any brand | ||
| Culture rotator in 30 °C incubator | Shaker incubator can be used instead | ||
| 96 well round bottom plates | Sterile, any brand | ||
| 3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Autoclave before use |
| 12-channel pipettes | Any brand | ||
| Ex Taq DNA Polymerase | TaKaRa | RR001 | |
| Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit | Epicenter | MPY80200 | |
| 3 M sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| 100% ethanol | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | Newer model available |
| dsDNA BR Assay kit | Invitrogen | Q32850 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Ficoll 400 | Dot Scientific Inc. | DSF10400 | |
| Bromocresol green | Eastman | 6356 | |
| Xylene cyanol FF | International Technologies Inc. | 72120 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.0) | Teknova | T5080 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | |
| UV transilluminator | |||
| Amersham Nylon membrane Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN303B | |
| 3 MM CHR Chromotography paper | Whatman | 3030-392 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| G-25 spin column | GE Healthcare | 27-5325-01 | |
| 1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2) | Sigma-Aldrich | NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390) |
|
| SDS | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671 | |
| Geiger counter |
References
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