Studiare Ribonucleotide incorporazione: Strand-specifico rilevamento di ribonucleotidi nel genoma del lievito e mutagenesi indotta da Ribonucleotide di misura
Summary
Ribonucleotidi sono tra i più abbondanti nucleotidi non canonico incorporati nel genoma durante la replicazione del DNA nucleare negli eucarioti. Se non correttamente rimosso, ribonucleotidi possono causare mutagenesi e danno del DNA. Qui, presentiamo due approcci sperimentali che sono utilizzati per valutare l’abbondanza di incorporazione ribonucleotide del DNA e dei suoi effetti mutageni.
Abstract
La presenza di ribonucleotidi in DNA nucleare ha dimostrata di essere una fonte di instabilità genomica. La misura dell’incorporazione del ribonucleotide può essere valutata da idrolisi alcalina ed elettroforesi su gel come RNA è altamente suscettibile di idrolisi in condizioni alcaline. Questo, in combinazione con l’analisi del sud della macchia può essere utilizzato per determinare la posizione e filo in cui sono stati incorporati i ribonucleotidi. Tuttavia, questa procedura è solo semi-quantitativa e potrebbe non essere abbastanza sensibile da rilevare piccole variazioni nel contenuto ribonucleotide, sebbene filo specifico del sud della macchia di sondaggio migliora la sensibilità. Come misura di uno delle conseguenze biologiche più eclatante di ribonucleotidi nel DNA, mutagenesi spontanea possono essere analizzata usando un’analisi di mutazione in avanti. Utilizzando i geni reporter appropriato, mutazioni rare che comporta la perdita della funzione possono essere selezionata e nel complesso e tassi di mutazione specifica possono essere misurati mediante la combinazione di dati provenienti da esperimenti di fluttuazione con sequenziamento del DNA del gene del reporter. Il test di fluttuazione è applicabile per esaminare un’ampia varietà di processi mutageni in background genetico specifico o le condizioni di crescita.
Introduction
Durante la replicazione nucleare eucariotiche, ribonucleotidi sono incorporati nel genoma di tutti i tre principali replicases di DNA, DNA polimerasi (Pols) α, ε e δ1,2. Riparazione per escissione RNasi H2-dipendente ribonucleotide (RER3) rimuove la maggior parte di questi ribonucleotidi incorporati.
Un ribonucleotide nel DNA è suscettibile di idrolisi, come il gruppo dell’idrossile 2′ della parte dello zucchero in grado di attaccare il legame fosfodiesterico adiacente, rilasciando un’estremità con un 2′ – 3′ fosfato ciclico e l’altra con un 5′-OH4. Condizioni alcaline possono notevolmente accelerare questa reazione. Così, l’idrolisi di ribonucleotidi incorporati durante l’incubazione in una soluzione di base provoca la frammentazione del DNA genomico, che possa essere visualizzata da alcalino-agarosio elettroforesi5. Questo DNA può essere trasferito ad una membrana e sondato dall’analisi del sud della macchia usando sonde di strand-specific che permettono l’identificazione dei siti alcali-sensibile causato da ribonucleotidi incorporati nel nascente leader – o in ritardo-filo del DNA, rispettivamente.
In cellule di lievito che difetta dell’attività RNasi H2, rimozione di ribonucleotidi può essere avviato quando topoisomerasi io (Top1) Nick il DNA al incorporato ribonucleotide6,7. Tuttavia, quando Top1 si unirà sul lato 3′ della ribonucleotide, questo genera 5′-OH e 2′ – 3′ fosfato ciclico DNA finisce che sono refrattari alla religation. La mancata riparazione o l’elaborazione aberrante di questi ‘estremità sporca’ può portare a instabilità genomica. Inoltre, se l’incisione avviene all’interno di una sequenza ripetuta di DNA, il processo di ripristino può portare a mutazioni di omissione. Ciò è particolarmente problematico per ripetizioni in tandem, dove breve eliminazioni (di tra due e cinque coppie di basi) sono comunemente osservati in cellule RNasi H2-carenti. Gli effetti deleteri di Top1-dipendente in assenza di lievito RNasi H2 attività sono aggravate in un mutante ε di DNA polimerasi (pol2-M644G) promiscuo per incorporazione ribonucleotide durante la sintesi di filo leader nascente.
Elaborazione di ribonucleotidi in DNA conduce a mutazioni spontanee e la mutagenesi può essere rilevata utilizzando geni reporter appropriato e selezionando per il cambiamento fenotipico accompagnamento. Un test di fluttuazione o esperimento Luria e Delbrück è uno dei metodi più comunemente usati per misurare i tassi di mutazione spontanea utilizzando geni reporter selezionabile8,9. In lievito, i geni URA3 e CAN1 possono essere utilizzati come reporter nel test di mutazione in avanti, che consente il rilevamento di tutti i tipi di mutazione che provocano la perdita della funzione del gene. Il tasso di mutazione spontanea è stimato come la mediana di quello osservato per più culture parallele iniziate dalle singole colonie senza mutazioni del gene del reporter di destinazione. Un lievito ceppo RNasi H2-carente come rnh201Δ ha un tasso di mutazione spontanea nel complesso moderatamente elevato che è in gran parte causato da un’elevata incidenza di 2-5 eliminazioni di bp in tandem ripetere sequenze. Così, per caratterizzare completamente gli effetti mutageni di ribonucleotidi nel genoma, tassi di mutazione specifico necessario determinare. In questo caso, i geni reporter URA3 o CAN1 possono essere amplificati ed ordinati per determinare i tipi e le posizioni delle mutazioni, e tassi di mutazione specifica possono essere calcolati. Compilazione di mutazioni identificate in mutanti URA3 o CAN1 indipendenti multipli quindi può essere utilizzata per generare uno spettro di mutazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, descriviamo i protocolli per due serie di esperimenti che vengono spesso utilizzati per analizzare semi-quantitativamente ribonucleotidi incorporati durante la replicazione del DNA e gli effetti mutageni di ribonucleotidi non riparati. Sebbene questi approcci comportano eucariote il modello S. cerevisiae, queste tecniche possono essere facilmente adattate ad altri microbi e persino più alti eucarioti.
Sondaggio per ribonucleotidi non riparati nel DNA usando l’elettroforesi alcal…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo tutti i membri attuali ed ex Kunkel Lab per il loro lavoro e discussioni relative al protocollo e riutilizzare i dati presentati qui. Questo lavoro è stato sostenuto dal progetto Z01 ES065070 a T.A.K. dalla divisione di ricerca intramurale degli istituti nazionali di salute (NIH), National Institute di Environmental Health Sciences (NIEHS).
Materials
| YPD media | 20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H2O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave. | ||
| COM plates | 1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H2O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 – 35 ml per plate. | ||
| CAN plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 56 °C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution. | ||
| 5-FOA plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 60 °C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution. | ||
| L-Canavanine sulfate | US Biological | C1050 | |
| 5-FOA | US Biological | F5050 | |
| 20 mL glass culture tube | Any brand | ||
| Culture rotator in 30 °C incubator | Shaker incubator can be used instead | ||
| 96 well round bottom plates | Sterile, any brand | ||
| 3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Autoclave before use |
| 12-channel pipettes | Any brand | ||
| Ex Taq DNA Polymerase | TaKaRa | RR001 | |
| Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit | Epicenter | MPY80200 | |
| 3 M sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| 100% ethanol | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | Newer model available |
| dsDNA BR Assay kit | Invitrogen | Q32850 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Ficoll 400 | Dot Scientific Inc. | DSF10400 | |
| Bromocresol green | Eastman | 6356 | |
| Xylene cyanol FF | International Technologies Inc. | 72120 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.0) | Teknova | T5080 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | |
| UV transilluminator | |||
| Amersham Nylon membrane Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN303B | |
| 3 MM CHR Chromotography paper | Whatman | 3030-392 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| G-25 spin column | GE Healthcare | 27-5325-01 | |
| 1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2) | Sigma-Aldrich | NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390) |
|
| SDS | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671 | |
| Geiger counter |
References
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