Estudando ribonucleótido incorporação: Deteção de vertente específica de ribonucleotídeos no genoma da levedura e mutagênese induzida pela ribonucleotídeo de medição
Summary
Ribonucleotídeos estão entre os mais abundantes nucleotídeos não-canônicos incorporados do genoma durante a replicação do DNA nuclear eucariótica. Se não forem devidamente removidos, ribonucleotídeos podem causar mutagênese e dano do ADN. Aqui, apresentamos duas abordagens experimentais que são usadas para avaliar a abundância de incorporação de ribonucleotídeo DNA e seus efeitos mutagénicos.
Abstract
A presença de ribonucleotídeos no DNA nuclear tem demonstrada ser uma fonte de instabilidade genômica. A extensão da incorporação do ribonucleotídeo pode ser avaliada por hidrólise alcalina e electroforese do gel como o RNA é altamente suscetível à hidrólise em condições alcalinas. Isto, em combinação com a análise de Southern blot pode ser usado para determinar a localização e a vertente em que foram incorporados os ribonucleotídeos. No entanto, este procedimento só é semiquantitativo e pode não ser suficientemente sensível para detectar pequenas alterações no conteúdo do ribonucleotídeo, apesar de Southern blot vertente específica de sondagem melhora a sensibilidade. Como uma medida de uma das consequências mais marcantes de ribonucleotídeos no DNA biológicas, mutagênese espontânea pode ser analisado usando um ensaio de mutação para a frente. Usando genes repórter apropriado, raras mutações que resulta na perda de função podem ser selecionada e total e taxas de mutação específico podem ser medidas pela combinação de dados das experiências de flutuação com o sequenciamento de DNA do gene repórter. O ensaio de flutuação é aplicável para examinar uma ampla variedade de processos mutagênicos no fundo genético específico ou condições de crescimento.
Introduction
Durante a replicação do DNA eucariótica nuclear, ribonucleotídeos são incorporados ao genoma por todos os três principais replicases de DNA, DNA polimerase (Pols) α, ε e δ1,2. Reparo de excisão do RNase H2-dependente ribonucleótido (RER3) remove a maioria destes ribonucleotídeos incorporados.
Um ribonucleótido no DNA é suscetível à hidrólise, como 2′ grupo hidroxila da fracção de açúcar pode atacar o fosfodiéster adjacente, liberando uma extremidade com um fosfato cíclico 2′ – 3′ e o outro com uma 5′-OH4. Condições alcalinas grandemente podem acelerar esta reação. Assim, a hidrólise de ribonucleotídeos incorporados durante a incubação em uma solução básica causa a fragmentação de DNA genômico, que pode ser visualizado por electroforese de agarose alcalina5. Este DNA pode ser transferido para uma membrana e analisado pela análise de Southern blot utilizando sondas de vertente específicas que permitem a identificação dos locais sensíveis ao alcaloide causada por ribonucleotídeos incorporados para o nascente líder – ou revestimento-strand DNA, respectivamente.
Em células de levedura, falta de atividade RNase H2, remoção de ribonucleotídeos pode ser iniciada quando topoisomerase eu (Top1) rouba o DNA incorporado ribonucleótido6,7. No entanto, quando Top1 fende do lado 3′ o ribonucleotídeo, isso gera 5′-OH e 2′ – 3′ fosfato cíclica DNA extremidades que são refratárias a religation. A reparação ou transformação aberrante destas extremidades’ sujas’ pode provocar instabilidade genômica. Além disso, se a incisão ocorre dentro de uma sequência de DNA a repetição, o processo de reparação pode levar a mutações de exclusão. Isto é particularmente problemático para repetições em tandem, onde curto exclusões (de entre dois e cinco pares de bases) são comumente observados em células de RNase H2-deficiente. Os efeitos deletérios de Top1-dependente na ausência de levedura RNase H2 atividade são exacerbados em um mutante ε da DNA polimerase (pol2-M644G) promíscuo para incorporação ribonucleótido durante a síntese de vertente principal nascente.
Processamento de ribonucleotídeos no DNA leva a mutações espontâneas e este mutagênese pode ser detectada usando genes repórter apropriado e selecionando para a mudança fenotípica que acompanha. Um teste de flutuação ou experiência de Luria e Delbrück é um dos métodos mais comumente utilizados para medir taxas de mutação espontânea, usando o repórter selecionável genes8,9. Fermento, os genes URA3 e CAN1 podem ser usados como repórteres em um ensaio de mutação para a frente, o que permite a detecção de todos os tipos de mutação que resultam em perda da função do gene. A taxa de mutação espontânea é estimada como a mediana de observadas em múltiplas culturas paralelas, iniciadas a partir de colônias única sem mutações no gene repórter do alvo. Uma levedura RNase H2-deficiente estirpe como rnh201Δ tem uma taxa de mutação espontânea em geral moderadamente elevados em grande parte causada por uma elevada incidência de exclusões de 2-5 bp em tandem repeat sequências. Assim, para caracterizar totalmente os efeitos mutagênicos de ribonucleotídeos no genoma, taxas de mutação específica precisam ser determinado. Neste caso, os genes repórter URA3 ou CAN1 podem ser amplificados e sequenciados para determinar os tipos e locais das mutações, e taxas de mutação específica podem ser calculadas. Compilar as mutações identificadas em vários mutantes independentes de URA3 ou CAN1 então pode ser usado para gerar um espectro de mutação.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos os protocolos para dois conjuntos de experiências que são frequentemente usados para analisar semi-quantitativamente ribonucleotídeos incorporados durante a replicação do DNA e os efeitos mutagênicos de ribonucleotídeos não reparados. Embora essas abordagens envolvem a eucariota modelo S. cerevisiae, estas técnicas podem ser facilmente adaptadas para outros micróbios e eucariontes ainda maiores.
Sondagem para ribonucleotídeos não reparados no DNA utilizan…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todos os antigos e atuais membros Kunkel laboratório para os seus trabalhos e discussões relacionadas ao protocolo e reutilizados dados aqui apresentados. Este trabalho foi financiado pelo projeto Z01 ES065070 para T.A.K. da divisão de pesquisa Intramural dos institutos nacionais de saúde (NIH), National Institute de Ciências de saúde ambiental (NIEHS).
Materials
| YPD media | 20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H2O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave. | ||
| COM plates | 1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H2O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 – 35 ml per plate. | ||
| CAN plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 56 °C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution. | ||
| 5-FOA plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 60 °C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution. | ||
| L-Canavanine sulfate | US Biological | C1050 | |
| 5-FOA | US Biological | F5050 | |
| 20 mL glass culture tube | Any brand | ||
| Culture rotator in 30 °C incubator | Shaker incubator can be used instead | ||
| 96 well round bottom plates | Sterile, any brand | ||
| 3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Autoclave before use |
| 12-channel pipettes | Any brand | ||
| Ex Taq DNA Polymerase | TaKaRa | RR001 | |
| Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit | Epicenter | MPY80200 | |
| 3 M sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| 100% ethanol | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | Newer model available |
| dsDNA BR Assay kit | Invitrogen | Q32850 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Ficoll 400 | Dot Scientific Inc. | DSF10400 | |
| Bromocresol green | Eastman | 6356 | |
| Xylene cyanol FF | International Technologies Inc. | 72120 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.0) | Teknova | T5080 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | |
| UV transilluminator | |||
| Amersham Nylon membrane Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN303B | |
| 3 MM CHR Chromotography paper | Whatman | 3030-392 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| G-25 spin column | GE Healthcare | 27-5325-01 | |
| 1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2) | Sigma-Aldrich | NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390) |
|
| SDS | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671 | |
| Geiger counter |
References
- Joyce, C. M. Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 94 (5), 1619-1622 (1997).
- Nick McElhinny, S. A., et al. Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (11), 4949-4954 (2010).
- Sparks, J. L., et al. RNase H2-initiated ribonucleotide excision repair. Molecular Cell. 47 (6), 980-986 (2012).
- Li, Y., Breaker, R. R. Kinetics of RNA Degradation by Specific Base Catalysis of Transesterification Involving the 2′-Hydroxyl Group. Journal of the American Chemical Society. 121 (23), 5364-5372 (1999).
- Nick McElhinny, S. A., et al. Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA. Nature Chemical Biology. 6 (10), 774-781 (2010).
- Williams, J. S., Kunkel, T. A. Ribonucleotides in DNA: origins, repair and consequences. DNA Repair (Amst). 19, 27-37 (2014).
- Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (6), 350-363 (2016).
- Jones, M. E., Thomas, S. M., Rogers, A. Luria-Delbruck fluctuation experiments: design and analysis. Génétique. 136 (3), 1209-1216 (1994).
- Zheng, Q. A new practical guide to the Luria-Delbruck protocol. Mutat Research. 781, 7-13 (2015).
- Sambrook, J. . Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (2001).
- Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. The major roles of DNA polymerases epsilon and delta at the eukaryotic replication fork are evolutionarily conserved. PLoS Genetics. 7 (12), e1002407 (2011).
- Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. Ribonucleotides are signals for mismatch repair of leading-strand replication errors. Molecular Cell. 50 (3), 437-443 (2013).
- Williams, J. S., et al. Topoisomerase 1-mediated removal of ribonucleotides from nascent leading-strand DNA. Molecular Cell. 49 (5), 1010-1015 (2013).
- Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 185-191 (2015).
- Foster, P. L. Methods for determining spontaneous mutation rates. Methods Enzymology. 409, 195-213 (2006).
- Williams, J. S., et al. Evidence that processing of ribonucleotides in DNA by topoisomerase 1 is leading-strand specific. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (4), 291-297 (2015).
- Pavlov, Y. I., Shcherbakova, P. V., Kunkel, T. A. In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta. Génétique. 159 (1), 47-64 (2001).
- Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).
- Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon. DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).
- Lujan, S. A., et al. Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity. PLoS Genetics. 8 (10), e1003016 (2012).
- Reijns, M. A., et al. Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development. Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).
- Lujan, S. A., et al. Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition. Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).
