Изучение рибонуклеотид включение: Обнаружение Strand конкретных Ribonucleotides в геноме дрожжей и измерения рибонуклеотид индуцированного мутагенеза
Summary
Ribonucleotides относятся к числу наиболее распространенных неканонических нуклеотидов, включения в Геном эукариот ядерных репликации ДНК. Если удалены не должным образом, ribonucleotides может вызвать повреждение ДНК и мутагенез. Здесь мы представляем две экспериментальные подходы, которые используются для оценки обилие рибонуклеотид включения в ДНК и мутагенных эффектов.
Abstract
Наличие ribonucleotides в ядерной ДНК было показано, быть источником геномной нестабильности. Степень включения рибонуклеотид могут быть оценены щелочной гидролиз и электрофорез геля, как РНК, является очень восприимчивы к гидролизу в щелочных условиях. Это, в сочетании с юга блот анализ может использоваться для определения местоположения и прядь в который были включены ribonucleotides. Однако эта процедура является только полуколичественного и не может быть достаточно чувствительным, чтобы обнаружить небольшие изменения в содержании рибонуклеотид, хотя Южная помарка стренги конкретных зондирующего улучшает чувствительность. Как мера одного из самых ярких биологических последствий ribonucleotides в ДНК спонтанного мутагенеза могут быть проанализированы с использованием пробирного вперед мутации. Используя соответствующие репортер генов, редкой мутации, которые приводит к потере функции может быть отдельных и общих и конкретных мутаций ставки может измеряться путем объединения данных из колебаний эксперименты с секвенирования ДНК гена репортера. Assay колебания применимо рассмотреть широкий спектр мутагенных процессов в конкретных генетический фон или условий роста.
Introduction
Во время эукариотических ядерных репликации ДНК ribonucleotides включены в геноме всех трех основных replicases ДНК, ДНК полимеразы (Pols) α, ε и δ1,2. РНКазы H2-зависимых рибонуклеотид иссечение ремонт (3RER) удаляет большинство этих встроенных ribonucleotides.
Рибонуклеотид в ДНК подвержен гидролизу, как 2′ гидроксильной группы части молекулы сахара может атаковать прилегающих Фосфодиэфирная связь, выпустив один конец с 2′ – 3′ циклических фосфата и другой с 5′-OH-4. Щелочная среда может значительно ускорить эту реакцию. Таким образом гидролиз встраиваемых ribonucleotides во время инкубации в основной раствор вызывает фрагментацию геномной ДНК, которые могут быть визуализированы щелочной агарозы электрофорез5. ДНК может быть передана мембраны и исследован, Южная помарка анализа с помощью зондов нити конкретные, которые позволяют выявлять щелочно чувствительных участков, вызванные ribonucleotides, включены в зарождающейся ведущих – или теплоизоляции strand ДНК, соответственно.
В клетках дрожжей не хватает активности РНКазы H2 удаление ribonucleotides может быть инициировано когда Топоизомераза I (Top1) Никс ДНК на встраиваемых рибонуклеотид6,7. Однако когда Top1 расщепляет на стороне 3′ рибонуклеотид, это генерирует 5′-OH и 2′ – 3′ циклических фосфат ДНК концы которые огнеупоров для religation. Неспособность ремонт, или аномальным обработка этих «грязные концы» может привести к геномной нестабильности. Кроме того если разрез происходит внутри повторяющихся последовательностей ДНК, процесс восстановления может привести к удаления мутации. Это особенно проблематично для тандемные повторы, где короткие удаления (из между 2 и 5 пар оснований) обычно наблюдается в клетках РНКазы H2-недостаточным. Top1-зависимых пагубные последствия в отсутствие дрожжей РНКазы H2 активности усиливаются в прослушивающем для включения рибонуклеотид во время зарождающейся ведущих стренги синтеза мутант ε ДНК-полимеразы (pol2-M644G).
Обработка ribonucleotides в ДНК приводит к спонтанной мутации и этот мутагенеза можно обнаружить с помощью соответствующих репортер генов, выбрав для сопровождающих фенотипические изменения. Колебания тест или Лурия и Дельбрюк эксперимент является одним из наиболее часто используемых методов для измерения скорости спонтанной мутации, с помощью выбираемых репортер генов8,9. В дрожжей URA3 и CAN1 генов может использоваться как журналистам в assay вперед мутации, которая позволяет для обнаружения всех типов мутаций, приводящих к потере функции гена. Уровень спонтанной мутации оценивается как средний показатель наблюдается для нескольких параллельных культур, начал с одной колонии без мутации в гене репортер целевой. Дрожжи, RNase H2-недостаточным напрягаться, такие, как rnh201Δ имеет умеренно повышенной скоростью целом спонтанной мутации, во многом вызванные повышенной заболеваемости 2-5 bp удалений в тандеме повторить последовательности. Таким образом чтобы полностью характеризуют мутагенных эффектов ribonucleotides в геноме, скорости конкретной мутации должны определяться. В этом случае URA3 или CAN1 репортер генов может быть усиливается и последовательности для определения типа и местоположения мутаций, и скорости конкретной мутации могут быть рассчитаны. Компиляция мутации, определены в нескольких независимых URA3 или CAN1 мутантов, затем может использоваться для создания спектра мутаций.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем протоколы для двух наборов экспериментов, которые часто используются для полу количественно анализа включены во время репликации ДНК и мутагенных эффектов неустраненный ribonucleotides ribonucleotides. Хотя эти подходы включают модель эукариоты S. cerevisiae, эти методы можно лег?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим всех нынешних и бывших членов Канкел лаборатории за их работу и обсуждения связанных с протоколом и повторно использованы данные, представленные здесь. Эта работа была поддержана проект Z01 ES065070 для T.A.K. из отдела интрамуральных исследования национальных институтов здравоохранения (НИЗ), Национальный институт окружающей среды медицинских наук (NIEHS).
Materials
| YPD media | 20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H2O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave. | ||
| COM plates | 1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H2O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 – 35 ml per plate. | ||
| CAN plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 56 °C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution. | ||
| 5-FOA plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 60 °C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution. | ||
| L-Canavanine sulfate | US Biological | C1050 | |
| 5-FOA | US Biological | F5050 | |
| 20 mL glass culture tube | Any brand | ||
| Culture rotator in 30 °C incubator | Shaker incubator can be used instead | ||
| 96 well round bottom plates | Sterile, any brand | ||
| 3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Autoclave before use |
| 12-channel pipettes | Any brand | ||
| Ex Taq DNA Polymerase | TaKaRa | RR001 | |
| Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit | Epicenter | MPY80200 | |
| 3 M sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| 100% ethanol | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | Newer model available |
| dsDNA BR Assay kit | Invitrogen | Q32850 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Ficoll 400 | Dot Scientific Inc. | DSF10400 | |
| Bromocresol green | Eastman | 6356 | |
| Xylene cyanol FF | International Technologies Inc. | 72120 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.0) | Teknova | T5080 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | |
| UV transilluminator | |||
| Amersham Nylon membrane Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN303B | |
| 3 MM CHR Chromotography paper | Whatman | 3030-392 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| G-25 spin column | GE Healthcare | 27-5325-01 | |
| 1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2) | Sigma-Aldrich | NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390) |
|
| SDS | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671 | |
| Geiger counter |
References
- Joyce, C. M. Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 94 (5), 1619-1622 (1997).
- Nick McElhinny, S. A., et al. Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (11), 4949-4954 (2010).
- Sparks, J. L., et al. RNase H2-initiated ribonucleotide excision repair. Molecular Cell. 47 (6), 980-986 (2012).
- Li, Y., Breaker, R. R. Kinetics of RNA Degradation by Specific Base Catalysis of Transesterification Involving the 2′-Hydroxyl Group. Journal of the American Chemical Society. 121 (23), 5364-5372 (1999).
- Nick McElhinny, S. A., et al. Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA. Nature Chemical Biology. 6 (10), 774-781 (2010).
- Williams, J. S., Kunkel, T. A. Ribonucleotides in DNA: origins, repair and consequences. DNA Repair (Amst). 19, 27-37 (2014).
- Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (6), 350-363 (2016).
- Jones, M. E., Thomas, S. M., Rogers, A. Luria-Delbruck fluctuation experiments: design and analysis. Génétique. 136 (3), 1209-1216 (1994).
- Zheng, Q. A new practical guide to the Luria-Delbruck protocol. Mutat Research. 781, 7-13 (2015).
- Sambrook, J. . Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (2001).
- Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. The major roles of DNA polymerases epsilon and delta at the eukaryotic replication fork are evolutionarily conserved. PLoS Genetics. 7 (12), e1002407 (2011).
- Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. Ribonucleotides are signals for mismatch repair of leading-strand replication errors. Molecular Cell. 50 (3), 437-443 (2013).
- Williams, J. S., et al. Topoisomerase 1-mediated removal of ribonucleotides from nascent leading-strand DNA. Molecular Cell. 49 (5), 1010-1015 (2013).
- Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 185-191 (2015).
- Foster, P. L. Methods for determining spontaneous mutation rates. Methods Enzymology. 409, 195-213 (2006).
- Williams, J. S., et al. Evidence that processing of ribonucleotides in DNA by topoisomerase 1 is leading-strand specific. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (4), 291-297 (2015).
- Pavlov, Y. I., Shcherbakova, P. V., Kunkel, T. A. In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta. Génétique. 159 (1), 47-64 (2001).
- Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).
- Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon. DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).
- Lujan, S. A., et al. Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity. PLoS Genetics. 8 (10), e1003016 (2012).
- Reijns, M. A., et al. Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development. Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).
- Lujan, S. A., et al. Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition. Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).
