Incorporation de ribonucléotide Experimentation : Strand spécifiques détection des ribonucléotides dans le génome de la levure et mutagénèse induite par la ribonucléotide de mesure

Summary

Ribonucléotides sont parmi les plus abondantes nucléotides non-canoniques incorporés dans le génome au cours de la réplication de l’ADN nucléaire eucaryote. Si pas correctement supprimé, ribonucléotides peuvent provoquer de mutagenèse et dommages à l’ADN. Nous présentons ici deux approches expérimentales qui sont utilisés pour évaluer l’abondance de l’incorporation de ribonucléotide dans l’ADN et de ses effets mutagènes.

Abstract

La présence des ribonucléotides dans l’ADN nucléaire s’est avérée être une source d’instabilité génomique. La mesure de l’incorporation de ribonucléotide peut être évaluée par hydrolyse alcaline et électrophorèse sur gel que l’ARN est très sensible à l’hydrolyse en milieu basique. Ceci, en combinaison avec une analyse Southern peut servir à déterminer l’emplacement et le chapelet dans les ribonucléotides qui ont été incorporés. Toutefois, cette procédure est seulement semi-quantitative et peut-être pas assez sensible pour détecter de petits changements dans le contenu de ribonucléotide, bien que le volet spécifique Southern blot sonder améliore la sensibilité. Titre de l’un des plus frappants conséquences biologiques des ribonucléotides dans l’ADN, mutagenèse spontanée peut être analysée à l’aide d’un test de mutation vers l’avant. En utilisant les gènes appropriés, des mutations rares qui entraîne la perte de fonction peuvent être sélectionné et global et taux de mutation spécifique peuvent être mesurées en combinant les données des expériences de fluctuation avec le séquençage de l’ADN du gène rapporteur. L’essai de fluctuation est il y a lieu d’examiner un large éventail de processus mutagènes dans les antécédents génétiques spécifiques ou des conditions de croissance.

Introduction

Au cours de la réplication de l’ADN nucléaire eucaryote, ribonucléotides sont incorporées dans le génome de tous les trois principaux replicases de l’ADN, ADN polymérases (PPS) α, ε et δ^1,2. Réparation par excision de RNase H2-dépendante ribonucléotide (RER³) supprime la plupart de ces ribonucléotides incorporés.

Un ribonucléotide dans l’ADN est sensible à l’hydrolyse, le 2' groupe hydroxyle de la portion de sucre peut attaquer la liaison phosphodiester adjacente, libérant une extrémité avec un 2' - 3' phosphate cyclique et l’autre avec une 5'-OH

Protocol

1. alcaline hydrolyse et Strand spécifiques Southern Blot (Figure 1)

1. La croissance cellulaire et l’isolement d’ADN génomique
   1. Isoler l’ADN génomique de levure à l’aide d’une levure kit de purification d’ADN suivant les instructions du fabricant. Utilisez les cultures qui se trouvent dans la phase exponentielle de croissance entre (densité optique de 0,5) et 1. Resuspendre le culot d’ADN final dans 35 mL de 1 x tampon TE (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 1 mM).
   2. Ajouter 1 mL de 5 mg/mL RNase A dans l’ADN et incuber 30 min à 37 ° C.
   3. Précipiter l’ADN à l’aide de volu....

Results

Traitement d’ADN génomique à l’alcali, suivi par électrophorèse sur gel alcalin permet une détection semi-quantitative de la fragmentation de l’ADN en raison de l’abondance des ribonucléotides stablement incorporés. La figure 2 montre les images de gel de levure ADN génomique traité avec ou sans KOH⁵. La variante M644L de Pol2, la sous-unité catalytique de la Polε, a réduit la capacité d’incorporer des ribonucléotides tandis que le mut.......

Discussion

Nous décrivons ici les protocoles des deux séries d’expériences qui sont fréquemment utilisés pour analyser quantitativement semi ribonucléotides constituées au cours de la réplication de l’ADN et les effets mutagènes des ribonucléotides non réparés. Bien que ces approches impliquent l’eucaryote modèle S. cerevisiae, ces techniques peuvent être facilement adaptés à d’autres microbes et eucaryotes supérieurs même.

De détection des ribonucléotides non réparés dans l’ADN à l’aide d’alcal.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
		YPD	20 g de dextrose, 20 g de peptone, 10 g d’extrait de levure, en H2O désionisé jusqu’à 1 L, ajouter 20 g de gélose Bacto pour milieu solide, autoclave.
Plaques			1,3 g de mélange de chute SC, 1,7 g de base azotée de levure sans acides aminés ou (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g de dextrose, 20 g de gélose Bacto désionisée H2O jusqu’à 1 L. Ajuster le pH à 5,8. Autoclave et 30 &ndash ; 35 ml par assiette.
Plaques			1,3 g de poudre de chute SC-Ura, 1,7 g de base azotée de levure sans acides aminés ou (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g de dextrose, 20 g d’agar Bacto, 25 mg d’uracile et H2O jusqu’à 1 L. Autoclave pendant 15 min à 121 ° ; C et refroidir à 56 °C. Ajouter 6 mL de solution de sulfate de canavanine à 1 % stérilisée par filtre.
5-FOA en plaques			1,3 g de poudre de chute SC-Ura, 1,7 g de base azotée de levure sans acides aminés ou (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g de dextrose, 20 g de gélose Bacto, 25 mg d’uracile et H2O jusqu’à 800 mL. Autoclave pendant 15 mins à 121 ° ; C et refroidir à 60 °C. Ajouter 200 mL de solution de 5-FOA stérilisée par filtre à 0,5 %.
L-Canavanine	sulfate US Biological	C1050
5-FOA	US Biological	F5050
Tube			N’importe quelle marque
Rotateur de culture en 30 ° ; Incubateur			C L’incubateur Shaker peut être utilisé à la place
96 plaques			Stérile, n’importe quelle marque
Perles de verre de 3 mm	Fisher Scientific	11-312A	Autoclave avant utilisation Pipettes
		à 12 canaux	N’importe quelle marque
Ex Taq DNA Polymérase	TaKaRa	RR001
Epicentre MasterPure Yeast DNA Kit de purification	Epicenter	MPY80200
3 M acétate de sodium	Sigma-Aldrich	S7899
Fluorimètre 100 % éthanol
Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866	Modèle plus récent disponible
dsDNA BR Kit de dosage	Invitrogen	Q32850
KOH	Sigma-Aldrich	221473
EDTA	Sigma-Aldrich	E7889
Ficoll 400	Dot Scientific Inc.
Vert bromocrésol	Eastman	6356
Xylène cyanol FF	International Technologies Inc.	72120
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045
1 M Tris-HCl (pH 8,0)	Teknova	T5080
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	Invitrogen	S11494
Transilluminateur
Amersham Membrane nylon Hybond-N+	GE Healthcare	RPN303B
3 MM CHR Papier de chromotographie	Whatman	3030-392
NaCl	Caledon	7560-1
Stratalinker 1800	Stratagene
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
G-25 spin column	GE Healthcare	27-5325-01
1 M Tampon phosphate de sodium (pH 7,2)	Sigma-Aldrich	NaH2PO4 (S9638) ; Na2HPO4 (S9390)
SDS	Sigma-Aldrich	L4522
BSA	Sigma-Aldrich	A3059
Formamide	Sigma-Aldrich	47671
Compteur