Høj overførselshastighed DNA-ekstraktion og genotypebestemmelse af 3dpf zebrafisk larver af Fin klipning
Summary
Zebrafisk har været brugt som pålidelig genetiske modelorganismer i biomedicinsk forskning, især med fremkomsten af gene-redigering teknologier. Når larver fænotyper forventes, kan DNA udvinding og genotype identifikation være udfordrende. Her, beskriver vi en effektiv genotypebestemmelse procedure for zebrafisk larver, af hale klipning, så tidligt som 72-h efter befrugtning.
Abstract
Zebrafisk (Danio rerio) besidder orthologues til 84% af de gener kendt for at være forbundet med sygdomme hos mennesker. Derudover disse dyr har en kort generationstid, er let at håndtere, vise en høj formeringsevne, lave omkostninger, og er let indstillet til genetiske manipulationer ved mikroinjektion af DNA i embryoner. Seneste fremskridt inden for gen redaktion værktøj giver mulighed for præcis indførelsen af mutationer og transgener i zebrafisk. Sygdom modellering i zebrafisk ofte fører til larve fænotyper og tidlig død, som kan være en udfordring for at fortolke hvis genotyper er ukendt. Denne tidlig identifikation af genotyper er også nødvendige i eksperimenter der kræver prøven pooling, såsom i gen udtryk eller masse massespektrometri undersøgelser. Imidlertid er omfattende genotypiske screening begrænset af traditionelle metoder, som i de fleste øvelser udføres kun på voksne zebrafisk eller i postmortem larver. Vi har behandlet dette problem ved at tilpasse en metode til isolering af PCR-ready genomisk DNA fra live zebrafisk larver, der kan opnås så tidligt som 72 h efter befrugtning (hpf). Denne tid og omkostningseffektiv teknik, forbedret fra en tidligere udgivne genotypebestemmelse protokol, giver mulighed for identifikation af genotyper fra mikroskopiske fin biopsier. Finnerne regenerere hurtigt som larverne udvikle. Forskere er derefter i stand til at vælge og hæve de ønskede genotyper til voksenalderen ved at udnytte denne høj overførselshastighed PCR-baserede genotypebestemmelse procedure.
Introduction
For zebrafisk (Danio rerio) er en hvirveldyr organisme udbredt som en model for sygdom undersøgelse såvel som for præklinisk afprøvning af terapeutiske hypoteser1,2,3. Disse dyr har en kort generationstid, er let at håndtere, vise en høj formeringsevne, lave omkostninger, og er let indstillet til genetiske manipulationer ved mikroinjektion af DNA i embryoner4. Gennem den stigende udvikling af roman transgene og gen redigering teknologier såsom zink-Finger nukleaser (ZFN)5, TAL-lignende effektor nukleaser (TALENs)6,7, og de grupperede regelmæssigt Interspaced korte Palindromiske gentager (CRISPR) / CRISPR-associerede 9 (Cas9) system8, zebrafisk er klar til at forbedre forståelsen af flere patologiske betingelser. Disse teknologier har været brugt til at oprette målrettede knockouts i både somatiske og kønscelleoverførsel celler i zebrafisk, effektivt engendering genetisk modificerede dyr8. De seneste eksempler på i litteraturen omfatter en vellykket udvikling af genetiske modeller af epilepsi og metaboliske forstyrrelser i zebrafisk3,9,10,11,12 .
Med fremskridt i zebrafisk genom-redigering, blevet hurtig og pålidelig genotypebestemmelse en ubestridelig trafikhastighedsbegrænsning trin. Identifikation af specifikke DNA mutationer støder op til det forventede genom-redigering målwebstedet er en væsentlig etape i protokollen. Traditionelt er genotypebestemmelse teknikker af fin klipning normalt kun udført i unge eller voksne zebrafisk. Men tid brugt hæve zebrafisk til voksenalderen (> 2 måneder) betydeligt forsinker fremskridt inden for forskning. I mange tilfælde kan voksenalderen ikke opfyldes på grund af knockout af væsentlige gener (f.eks. i sygdom modellering) eller gevinst af funktion mutationer fører til skadelige fænotypisk virkninger. Derudover flere assays kræver pooling af larver, som i RNA eller metabolit udvinding, og dermed indebære forudgående identificering af genotyper, som kan være udfordrende, når kun post hoc genotypebestemmelse teknikker er til rådighed. Disse ovennævnte eksempler fremhæve betydningen af larve genotypebestemmelse teknikker, som er på samme tid præcist og aktiverer fuld helbredelse og normal udvikling af larverne. Tidlige fase zebrafisk genotypebestemmelse synes ikke i øjeblikket at være udbredt; Dette afspejles af de seneste publikationer af sygdomsmodeller som larve genotyper identificeres via post mortem genotypebestemmelse snarere end genotypebestemmelse forud for fuldbyrdelsen af eksperiment12,13,14. I dette papir præsenteres en larve fin klip strategi sigter mod at forbedre tidligere etablerede genotypebestemmelse procedurer.
I fortiden live strategier beskæftiger proteinase K fordøjelsen at genotype zebrafisk larver har ført til variabel polymerase kædereaktion (PCR) effektivitet15. Selv om en mere nylig offentliggjort mikroskopiske hale biopsi teknik leveres mere lovende resultater16, var vi og andre grupper ikke kan gengive den høje effektivitet og DNA opsving rapporteret af forfatterne. Et stort tilbageslag i protokollen beskrevet af Wilkinson et al. 16 kunne være overførsel af hale væv til PCR rør. På grund af mikroskopisk størrelse er det svært at sikre, at fin korrekt blev indsamlet og udleveres af pipettering. For at løse denne barriere, har vi udviklet en forbedret protokol til genotypebestemmelse stort antal levende zebrafisk larver med næsten 100% effektivitet9. Ved hjælp af en microscalpel, er spidsen af fin halen fjernet og placeret på et stykke filtrerpapir. Stykke filtrerpapir indeholdende væv kan let visualiseres og anbragt korrekt i en PCR rør. Genomisk DNA ekstraktion foretages derefter, efterfulgt af PCR-amplifikation af det pågældende område til genotype modellen. Fordelene ved denne metode omfatter en høj PCR effektivitet, et lavt falsk positiv rate og en lav dødelighed. Derudover er genotypebestemmelse af et stort antal embryoner muligt ved hjælp af denne protokol. Protokollen beskrevet heri giver fin-klipning af hundredvis af larver inden for 2-3 h ved hjælp af denne fremgangsmåde og korrekt identifikation af genotypebestemmes fisk og hale regenerering inden to dage.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gen redigeringsværktøjer er blevet ansat til netop indføre mutationer og transgener i zebrafisk i seneste år5,6,7,8. Når du udfører sygdom modellering i zebrafisk, er tidlig larve eller juvenil fænotyper ofte observeret9,12,13,14. Protokollen præsenteres her b…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke den sjældne sygdomsmodeller og mekanisme (RDMM) netværk (finansieret af den canadiske institutter for sundhed Research (CIHR) og genom Canada). CK er understøttet af en UROP scholarship award (University of Ottawa). DLJ understøttes af en Vanier Canada Graduate stipendium. IAP understøttes af en canadisk institutter for sundhed Research (CIHR) postdoc stipendium award. Forfatterne takke den Genetics Society of America for tilladelse til at offentliggøre denne protokol og til at bruge en tilpasning af den supplerende figur 5 fra Pena, mfl.
Materials
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| Microscalpel | World Precision Instruments | 500249 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 96-well Tissue-culture plate | Costar | 3595 | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| NaOH | Fisher | S25548A | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 5% Chelex 100 sodium form | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| GelRed 1x | Biotium | 41003 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Sub-Cell Model 192 system | Bio-Rad | 1704508 | |
| 30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1 | Bio-Rad | 1610158 | |
| GoTaq Green Master Mix, 2X | Promega | M7123 | |
| paper wipes (Kimwipes® disposable wipers) | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| 1kb-plus molecylar weight marker | Thermo Scientific | SM1343 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system) | Bio-Rad | 1704508 | |
| vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Stewart, A. M., Kalueff, A. V. Developing better and more valid animal models of brain disorders. Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).
- Grone, B. P., Baraban, S. C. Animal models in epilepsy research: legacies and new directions. Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
- Bedell, V. M., et al. In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Pena, I. A., et al. Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency. Génétique. 207, 1501-1518 (2017).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, 2410 (2013).
- Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae. J Neurochem. 135, 249-260 (2015).
- Scheldeman, C., et al. Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).
- Zabinyakov, N., et al. Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology. PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).
- Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS One. 11 (3), (2016).
- Kawakami, K., Hopkins, N. Rapid identification of transgenic zebrafish. Trends Genet. 12 (1), 9-10 (1996).
- Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
- Zhu, X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Sci Rep. 4, 6420 (2014).
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).
- Ewing, B., Green, P. Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Res. 8, 175-185 (1998).
