Toluidine bleu coloration des Sections enrobées dans la résine pour l’évaluation de la morphologie des nerfs périphériques

Résumé

Nous présentons ici un protocole afin de visualiser les structures fines des nerfs périphériques en obtenant et en coloration de 1 à 2 µm sections avec toluidine bleu

Résumé

Nerfs périphériques s’étendent dans tout le corps, qui innervent les tissus cibles avec les axones moteurs ou sensoriels. En raison de la généralisation, les nerfs périphériques sont souvent endommagés en raison d’un traumatisme ou d’une maladie. Méthodes et stratégies ont été développées pour évaluer les lésions des nerfs périphériques dans des modèles animaux, fonction et régénération, analysant la morphométrie des nerfs périphériques est devenue une mesure essentielle issue terminale. Points de coloration du nerf croix bleu de toluidine obtenues des sections nerveuses résine intégrée est une méthode reproductible pour les évaluations qualitatives et quantitatives des nerfs périphériques, permettant la visualisation de morphologie nombre d’axones et le degré de myélinisation. Cette technique, comme pour beaucoup d’autres méthodes histologiques, peut être difficile à apprendre et à maîtriser à l’aide de protocoles standard de l’écrits. Cette publication vise donc à accentuer des protocoles écrits pour la coloration des nerfs périphériques à la vidéographie de la méthode, à l’aide de nerfs sciatiques récoltés des rats bleu de toluidine. Dans ce protocole, nous décrivons la fixation in vivo des nerfs périphériques et collection du tissu et après fixation avec 2 % le tétroxyde d’osmium, incorporant des nerfs dans la résine époxyde et ultramicrotome sectionnement des nerfs à 2μm-1 épaisseur. Les sections nerveuses puis transféré à une lame de verre et colorées au bleu de toluidine, après quoi ils sont quantitativement et qualitativement évalués. Exemples de problèmes les plus courants sont indiqués, ainsi que des mesures pour atténuer ces problèmes.

Introduction

Nerfs périphériques s’étendent dans tout le corps, qui innervent les tissus cibles avec des axones moteurs ou sensoriels¹. Nerfs périphériques congénitales causées par des troubles médicaux et les traumatismes représentent un problème majeur de santé publique et ont de grandes incidences économiques^2,3. Malgré les progrès dans l’évaluation des résultats des lésions des nerfs périphériques et comprendre la régénération nerveuse, les méthodes traditionnelles comme l’histologie nerveuse et des techniques de coloration sont des outils indispensables pour évaluer qualitativement et quantitat....

Protocole

Rats Sprague Dawley adultes ont été utilisées dans ce projet et toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de l’utilisation et le soin des animaux institutionnels Université du Wyoming.

1. chirurgie et dans la Fixation du nerf Vivo

Remarque : Les informations sur le fournisseur pour tous les matériaux et équipements utilisés dans le présent protocole sont répertoriés dans la Table des matières.

NOTE : In vivo le fixation de nerf sert à préserver les tissus et réduire la dégradation structurelle qui peut survenir entre le moment de la mort et....

Résultats

Résine intégrée des nerfs périphériques sections colorées au toluidine bleues permettent des analyses quantitatives précises données histologiques. Un aperçu de la procédure apparaît (Figure 2). Sections de nerfs sciatiques incorporé dans le milieu de la résine et colorées au bleu de toluidine a montré clairement des images avec une résolution optimale (3 chiffres). Lésions nerveuses peuvent causer beaucoup de changements dans le nerf les str.......

Discussion

Examens des structures morphologiques des lésions du nerf périphérique et la régénération sont fréquents sujets d’étude¹³. Dans ce protocole, nous décrivons les étapes pour obtenir des images de haute qualité pour les analyses quantitatives de données histologiques à l’aide de tissu de nerf sciatique du rat incorporés dans des blocs de résine et colorées au bleu de toluidine. Cette technique fournit une image de la morphologie de nerf dans laquelle la régénération nerveuse peut être quantifiée en .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tampon phosphate salin Dulbecco’s Gibco		14200-075
Solution de glutaraldéhyde	Sigma-Aldrich	G6257
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	P6148
Phosphate de sodium monobasique monohydraté	Sigma-Aldrich	S9638
Bleu de toluidine O	Sigma-Aldrich	T3260
Tétraborate de sodium décahydraté	Acros Organics	205950010
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-013-25
Kit de milieu d’enrobage d’époxy	Sigma-Aldrich	45359
Solution d’hydroxyde de sodium	Sigma-Aldrich	72068	Pour ajuster le pH fixateur de Trump
Acétone	Fisher Chemical	170942
Solution de tétroxyde d’osmium	Sigma-Aldrich	75632
VWR Micro Slides, Superfrost Plus	VWR	48311-703
Couvercle de microscope Verre	Fisher Scientific	12545102
Pelco Embedding Cast	Fisher Scientific	NC9671811
Fabricant de couteaux en verre	RMC Products	GKM-2
Ultramicrotome	RMC Products	MT-XL
15 mL Tube conique	Falcon	ISO 9001
Eppendorf 1,5 mL Microcentrifugeuses	Sigma-Aldrich	T9661
4 mL Flacon en verre	Sigma-Aldrich	854190
Lames de rasoir	VWR	55411-050	Pour le rognage de blocs de résine
Perfect Loop	Microscopie électronique Sciences	70944	Pour ramasser de fines sections de résine
Bandes de couteau en verre Ultra 6,4 mm x 25 mm x 400 mm	Microscopie électronique Sciences	71012
100 Watt	Millipore  ;
Papier filtre Whatman	Pipette en plastique Sigma-Aldrich	WHA10010155
3 mL	Sigma-Aldrich	Z331740
	Instruments de précision mondiaux Microscope
		fluorescence Olympus	Caméra couleur et monochrome CCD, DP80

, , Four 6350115 Kit micro-chirurgical à