JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie du développement

Моделирование синаптических микросхемы с 3D Cocultures астроциты и нейроны от человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Published: August 16, 2018
doi:
10.3791/58034
, ,
1Center for Neuroregeneration, Department of Neurosurgery,Houston Methodist Research Institute

Summary

В этом протоколе мы стремимся, чтобы описать воспроизводимый метод для объединения отделить человеческих плюрипотентных стволовых клеток получены нейронов и астроциты вместе в 3D шар cocultures, поддержание этих сфер в Свободный плавающий условиях и впоследствии измерение активности синаптических цепи сфер с иммуноанализа и многоэлектродный массив записей.

Abstract

Барьер для нашего понимания того, как различные типы клеток и сигналы способствует синаптических цепи функции является отсутствие соответствующих моделей для изучения человеческого мозга. Одной из новых технологий для решения этой проблемы является использование три трехмерные (3D) Нейронные клеточных культур, называется «organoids» или «сфероидов», для долгосрочного сохранения включая молекулы внеклеточного адгезии межклеточных взаимодействий. Однако эти системы культуры, много времени и не систематически сгенерированный. Здесь мы подробно метод быстро и последовательно производить 3D cocultures нейронов и астроциты от человеческих плюрипотентных стволовых клеток. Во-первых, предварительно дифференцированной астроциты нейрональных прародителями отделить и рассчитывал. Далее, ячейки объединяются в сфере формирования блюда с Ро-киназы ингибитора и на конкретные показатели производить сферах воспроизводимость размеров. После нескольких недель культуры как плавающий сферы cocultures («астероиды») наконец секционного для иммуноокрашивания или покрытием на многоэлектродный массивы для измерения синаптических плотность и прочность. В целом ожидается, что этот протокол будет выход 3D нейронных сфер, которые отображают зрелых клеток тип ограничен маркеры, формируют функциональные синапсов и проявлять спонтанные синаптических сетевой всплеск активности. Вместе Эта система позволяет наркотиков скрининг и расследования механизмов болезни в более подходящие модели по сравнению с монослоя культур.

Introduction

Астроциты являются очень обильные глиальных клеток типа в пределах центральной нервной системы (ЦНС) с целым рядом функциональных обязанностей за пределами структурной поддержки. Через секрецию растворимых synaptogenic факторов и компонентов внеклеточного матрикса (ECM) астроциты помощи в создании и кластеризации зрелых синапсов во время развития1. Они также играют важную роль в поддержании здоровья и пластичности синапсов через внеклеточных сигналов2,3,4,5и способствуют долгосрочной стабильности гомеостаза среды, регулируя внеклеточного калия и глутамата, а также секрецию энергетических субстратов и СПС6,,78. Наконец они могут способствовать синапсах, воздействуя на внесинаптического течения9и может косвенно влиять на активность через другие типы клеток, таких как содействие миелинизации10. Что важно потому что аномалий или дисфункции астроциты может привести к много нервной синдромы и взрослых невропатология, существует очевидная необходимость включить астроциты наряду с нейронов в инженерии нейронных сетей в целях улучшения модели эндогенного мозга окружающей среды. Астроциты является неотъемлемой характеристикой является их способность динамического взаимодействия формы с нейрональных синапсах1,,1112. В отсутствие глии нейроны образуют ограниченное количество синапсов, которые в целом также не хватает функциональной зрелости13.

Человека астроциты морфологических, транскрипционный анализ и функциональные характеристики отображения — например увеличение размера и сложности ветвления, а также вегетационных генов — что не изъятый в грызунов12,14, 15. В результате исследования использования человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC)-производных нервные клетки получили широкое признание как средство изучения заболеваний ЦНС в пробирке при разработке Роман терапии, травмы модели и культура парадигмы16 ,17. Кроме того hPSCs разрешения на изучение человека синапса формирования и функции без необходимости в основной ткани18,19.

Барьер для нашего понимания того, как различные типы клеток и сигналы способствует синаптических цепи функции является отсутствие соответствующих моделей человеческого мозга. Существует необходимость для соответствующей платформы для резюмировать его синаптических сетей с высокой точностью и воспроизводимостью. Недавно, интерес возник в производстве систем 3D культуры (широко известный как «organoids», «сфероидов», или «мини-мозги»)20 для моделирования сложных трехмерных (3D) структур на сотовые и макро уровнях. 3D культуры систем сохраняют ECM и ячеек взаимодействия, которые обычно отсутствуют или ограниченные во время типичного 2D coculture парадигмы21,22. Обилие методы существуют для культивирования 3D нейронных сфероидов23,24,25; Однако, многие требуют длительных культуры периодов (месяцев до лет) для спонтанного развития и сохранения слоя, с пользователем выставке очень мало контроля над выходных данных.

Здесь мы иллюстрируем систематический способ быстро и последовательно биоинженер Нейронные взаимодействия среди нескольких типов клеток (предварительно дифференцированной нейронов и астроциты) полученных от hPSCs путем сборки клеток в сфере cocultures («астероиды»)26 , пилки морфологических сложности конкретного человека в 3D. Этой высокой плотности нервная система генерирует равномерно рассеяны нейронных подтипы, которые взять на зрелых свойств с течением времени и может быть показан или assayed в духе высокой пропускной способности. Мы показываем, в первый раз, что человека астроциты побудить синаптических сетевой всплеск активности в этих 3D cocultures. Кроме того этот протокол является легко адаптируется для создания сферы разных размеров, использовать клетки, указанный для различных региональных тождества ЦНС и для изучения взаимодействия нескольких других типов клеток по желанию.

Protocol

1. клетки культуры и подготовка реагента Примечание: Протоколы в этом разделе написаны в том порядке, в котором они появляются в протоколе дифференциации (раздел 2). Смотрите Таблицу материалов для материалов и Каталог номеров. Подготовьте пластины с по…

Representative Results

Когда выполняется должным образом, этот протокол будет производить определенные популяции функциональных cocultures астроциты28,,3334 и нейронов35 из hPSCs (Рисунок 1A-1C), как подробные ране?…

Discussion

В этом протоколе мы описываем систематический метод для производства 3D сфер нейронные cocultures. Сферах состоят из астроцитов и нейроны, которые являются производными независимо от hPSCs. Хотя не в центре внимания настоящего Протокола, поколение чистого популяций астроциты hPSCs28…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить д-р Эрик Ullian (UCSF) за интеллектуальный вклад в разработке этих процедур, д-р Майкл Уорд (НИЗ) для технических консультаций по iNeuron дифференциация и Саба Барлас для анализа предварительных изображений.

Materials

6 well plate Fisher Scientific 08-772-1B
15 ml conical tubes Olympus Plastics 28-101
Accutase Sigma A6964-100ML Detachment solution
AggreWell plate Stemcell Technologies 34850
Anti-Adherence Rinsing Solution Stemcell Technologies 7010 Prevent cell adhesion to microwell plates
Anti/anti Thermofisher 15240062
B27 Thermofisher 17504044 Media Supplement
BrainPhys neuronal medium Stemcell Technologies 5790 Neurophysiological basal medium alternative
Circular glass coverslips Neuvitro GG-12-oz
Cryostor CS10 Stemcell Technologies 7930 Cryopreservation medium with 10% DMSO
DMEM/F12 Thermofisher 10565-042 With GlutaMAX supplement
DMH-1 Stemcell Technologies 73634 HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM
Donkey serum Lampire Biological Laboratories 7332100 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Doxycycline Hydrochloride (Dox) Sigma D3072-1ml HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL
Epidermal growth factor (EGF) Peprotech AF-100-15 Working concentration: 10 ng/mL
Fibroblast growth factor-2 (FGF) Peprotech 100-18B Working concentration: 10 ng/mL
Fluoromount-G mounting solution Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisherbrand 22-037-246
Goat serum Lampire Biological Laboratories 7332500 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Hemacytometer or automatic cell counter Life Technologies AMQAX1000
Heparin Sigma H3149-50KU Working concentration: 2 mg/mL
Magnetic plate DLAB 8030170200
Matrigel membrane matrix Corning 354230 ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.
MEA 2100 System Multichannel Systems MEA2100
Mounting solution
N2 Thermofisher 17502048 Media Supplement
OCT Tissue-Tek 4583 Tissue embedding solution for cryosectioning
Pap Pen (Aqua Hold) Scientific Device Laboratory 9804-02
Paraformaldehyde (PFA) Acros Organics 169650025 HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS
Phosphate buffered saline (PBS) Stemcell Technologies CA008-300
Poly-l-ornithine (PLO) Sigma P3655-100MG Working concentration: 0.5 mg/mL
Rectangular glass cover slips Fisherfinest Premium Superslip 12-545-88
ReLeSR Stemcell Technologies 5872 Detachment and passaging reagent
Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y) Tocris 1254 Working concentration: 10 uM
SB431542 Stemcell Technologies 72234 Working concentration: 2 uM
Spinner flasks Fisher Scientific 4500-125
Sucrose Fisher Chemical S5-3 Working concentration: 20% or 30% in PBS
T25 Culture Flask Olympus Plastics 25-207 Vented caps
T75 Culture Flask Olympus Plastics 25-209 Vented caps
Terg-A-zyme Sigma Z273287-1EA Detergent. Working concentration: 1%
TeSR-E8 basal medium Stemcell Technologies 5940 Human pluripotent stem cell (hPSC) medium
TeSR-E8 supplements Stemcell Technologies 5940 Supplements for human pluripotent stem cell medium
TritonX-100 Sigma X100-500ML Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer
Trypan blue Invitrogen T10282
Antibodies
AlexaFluor 488 Thermofisher A-11029 Secondary antibody
AlexaFluor 594 Thermofisher A-11037 Secondary antibody
Ezrin Thermofisher MA5-13862 Primary antibody; astrocytes perisynaptic
GFAP Chemicon MAB360 Primary antibody; astrocytes
GFP Aves GFP-1020 Primary antibody; astrocytes
Glt1 Gift from Dr. Jeffrey Rothstein n/a Primary antibody; astrocytes
Homer Synaptic Systems 160 011 Primary antibody; neurons, post-synaptic
MAP2 Synaptic Systems 188 004 Primary antibody; neurons
PSD95 Abcam ab2723 Primary antibody; neurons, post-synaptic
S100 Abcam ab868 Primary antibody; astrocytes
Synapsin 1 Synaptic Systems 106 103 Primary antibody; neurons, pre-synaptic
TuJ1/β3-tubulin (TUBB3) Covance MMS-435P Primary antibody; neurons
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ullian, E. M., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Role for Glia in Synaptogenesis. Glia. 47, 209-216 (2004).
  2. Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
  3. Molofsky, A. V., et al. Astrocyte-encoded positional cues maintain sensorimotor circuit integrity. Nature. 509 (7499), 189-194 (2014).
  4. Sultan, S., et al. Synaptic Integration of Adult-Born Hippocampal Neurons Is Locally Controlled by Astrocytes. Neuron. 88, 957-972 (2015).
  5. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
  6. Cheung, G., Sibille, J., Zapata, J., Rouach, N. Activity-Dependent Plasticity of Astroglial Potassium and Glutamate Clearance. Neural Plasticity. , 109106 (2015).
  7. Ghezali, G., Dallerac, G., Rouach, N. Perisynaptic astroglial processes dynamic processors of neuronal information. Brain Struct Funct. 221, 2427-2442 (2016).
  8. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of Astrocytes and their Potential As Therapeutic Targets. Neurotherapeutics. 7, 338-353 (2010).
  9. Pál, B. Astrocytic Actions on Extrasynaptic Neuronal Currents. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 474 (2015).
  10. Kiray, H., Lindsay, S. L., Hosseinzadeh, S., Barnett, S. C. The multifaceted role of astrocytes in regulating myelination. Experimental Neurology. 283, 541-549 (2016).
  11. Allen, N. J., Eroglu, C. Cell Biology of Astrocyte-Synapse Interactions. Neuron. 96 (3), 697-708 (2017).
  12. Krencik, R., van Asperen, J. V., Ullian, E. M. Human astrocytes are distinct contributors to the complexity of synaptic function. Brain Research Bulletin. 129, 66-73 (2017).
  13. Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of Synapse Number by Glia. Science. 291, 657-662 (2001).
  14. Oberheim Bush, N. A., Nedergaard, M. Do Evolutionary Changes in Astrocytes Contribute to the Computational Power of the Hominid Brain?. Neurochemical Research. 42 (9), 2577-2587 (2017).
  15. Han, X., et al. Forebrain Engraftment by Human Glial Progenitor Cells Enhances Synaptic Plasticity and Learning in Adult Mice. Cell Stem Cell. 12 (3), 342-353 (2013).
  16. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. The EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
  17. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  18. Dodla, M. C., Mumaw, J., Stice, S. L. Role of astrocytes, soluble factors, cells adhesion molecules and neurotrophins in functional synapse formation: implications for human embryonic stem cell derived neurons. Stem Cell Res Ther. , 251-260 (2010).
  19. Krencik, R., Ullian, E. M. A cellular star atlas: using astrocytes from human pluripotent stem cells for disease studies. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 1-10 (2013).
  20. Pasca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  21. Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144, 938-941 (2017).
  22. Mason, J. O., Price, D. J. Building Brains in a Dish: Prospects for Growing Cerebral Organoids from Stem Cells. Neurosciences. 334, 105-118 (2016).
  23. Kelava, I., Lancaster, M. A. Dishing out mini-brains: Current progress and future prospects in brain organoid research. Biologie du développement. 420 (2), 199-209 (2016).
  24. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  25. Sloan, S. A., et al. Human Astrocyte Maturation Captured in 3D Cerebral Cortical Spheroids Derived from Pluripotent Stem Cells. Neuron. , 779-790 (2017).
  26. Krencik, R., et al. Systematic three-dimensional coculture rapidly recapitulates interactions between human neurons and astrocytes. Stem Cell Reports. 9 (6), 1745-1753 (2017).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Krencik, R., Zhang, S. -. C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 6 (11), 1710-1717 (2011).
  29. Du, Z. -. W., et al. Generation and expansion of highly pure motor neuron progenitors from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 6, 6626 (2015).
  30. Neely, M. D., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: Comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chemical Neuroscience. 3 (6), 482-491 (2012).
  31. Lippmann, E. S., Estevez-Silva, M. C., Ashton, R. S. Defined Human Pluripotent Stem Cell Culture Enables Highly Efficient Neuroepithelium Derivation Without Small Molecule Inhibitors. Stem Cells. 32, 1032-1042 (2014).
  32. Eggan, K., Kawada, J., Kaneda, S., Kirihara, T., Maroof, A. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9, 1441-1449 (2017).
  33. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -. J., Zhang, S. -. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  34. Krencik, R., et al. Dysregulation of astrocyte extracellular signaling in Costello syndrome. Science Translational Medicine. 7 (286), 286 (2015).
  35. Wang, C., et al. Scalable Production of iPSC-Derived Human Neurons to Identify Tau- Lowering Compounds by High-Content Screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  36. Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Frontiers in Neuroscience. 10, (2016).
  37. Kapucu, F. E., Mäkinen, M. E., Tanskanen, J. M. A., Ylä-Outinen, L., Narkilahti, S., Hyttinen, J. A. K. Joint analysis of extracellular spike waveforms and neuronal network bursts. Journal of Neuroscience Methods. 259, 143-155 (2016).
  38. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number. Journal of Visualized Experiments. 45, 2-9 (2010).
  39. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  40. Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture. Scientific reports. 6, 26181 (2016).
  41. Bardy, C., Hurk, , et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. PNAS. 112 (25), E2725-E2734 (2015).
  42. Monzel, A. S., et al. Derivation of Human Midbrain-Specific Organoids from Neuroepithelial Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1144-1154 (2017).
  43. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  44. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2018).
  45. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7647), 373-379 (2013).
  46. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  47. Yan, Y., et al. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. , 1-46 (2016).
  48. Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 9 (JAN), 423 (2015).
  49. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), 1-7 (2010).
  50. Shigetomi, E., Patel, S., Khakh, B. S. Probing the Complexities of Astrocyte Calcium Signaling. Trends in Cell Biology. 26 (4), 300-312 (2016).
  51. Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Lévi-strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat Methods. 14 (7), (2017).

Tags

Synaptic Microcircuit3D CoculturesAstrocytesNeuronsHuman Pluripotent Stem CellsNeural Cell TypesSynaptic Circuit FormationNeurosciencesOrganoid TechnologiesDrug DevelopmentNeuroregenerationNeural ProgenitorsAstrocyte ProgenitorsAstrocyte SubtypesNeural InductionNeural MediumRho-kinase InhibitorECM-coated PlatesCell AggregationCell DissociationCell Identity ConfirmationCryo-preservation
check_url/fr/58034?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Cvetkovic, C., Basu, N., Krencik, R. Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (138), e58034, doi:10.3791/58034 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image