Dans ce protocole, nous avons pour objectif de décrire une méthode reproductible pour les neurones de cellules souches dérivées pluripotentes humaines combinant dissociée et astrocytes ensemble en 3D sphère cocultures, maintenir ces sphères dans des conditions de flottement libres et par la suite mesure de l’activité synaptique circuit des sphères avec immunoanalyse et enregistrements multiélectrodes tableau.
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Article de méthode
Modélisation de Microcircuit synaptique avec 3D Cocultures d’Astrocytes et les neurones des cellules souches pluripotentes humaines
Dans cet article
Résumé
Résumé
Une barrière à la compréhension de comment les divers types de cellules et signaux contribuent au fonctionnement synaptique est le manque de modèles pertinents pour l’étude du cerveau humain. Une technologie émergente pour régler ce problème est l’utilisation de trois dimensions (3D) cellules neurales cultures, appelé « organoids » ou « sphéroïdes », pour la préservation à long terme des interactions intercellulaires, y compris les molécules d’adhérence extracellulaire. Toutefois, ces systèmes de culture sont longues et pas systématiquement généré. Ici, nous détaillons une méthode pour produire rapidement et uniformément des cocultures 3D des neurones et les astrocytes de pluripotentes humaines de cellules souches. Tout d’abord, différenciées des astrocytes et des progéniteurs neurones sont dissociées et comptés. Ensuite, les cellules sont combinées dans la sphère formant des plats avec un inhibiteur de la Rho-Kinase et à des rapports spécifiques pour produire des sphères de taille reproductible. Après plusieurs semaines de culture comme des sphères flottantes, cocultures (« astéroïdes ») sont finalement sectionnés pour immunostaining ou plaquées sur baies multiélectrodes pour mesurer la force et la densité synaptique. En général, il est prévu que ce protocole donnera 3D sphères neurones qui affichent des marqueurs de type cellule mature restreint, forment des synapses fonctionnelles et montrent une activité éclatement spontané réseau synaptique. Ensemble, ce système permet de dépistage des drogues et des enquêtes sur les mécanismes de la maladie dans un modèle plus approprié par rapport à des cultures monocouches.
Introduction
Avec une variété de responsabilités fonctionnelles au-delà de soutien structurel, les astrocytes sont un type de cellules gliales très abondante dans le système nerveux central (CNS). Par le biais de la sécrétion de facteurs solubles synaptogenic et constituants de la matrice extracellulaire (ECM), astrocytes aident à la mise en place et le regroupement des synapses matures au cours du développement1. Ils jouent un rôle essentiel dans le maintien de la santé et la plasticité des synapses à extracellulaire signalisation2,3,4,
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Protocole
1. Culture et préparation du réactif de cellules
Remarque : Les protocoles dans cette section sont écrits dans l’ordre dans lequel ils apparaissent dans le protocole de différenciation (section 2). Voir la Table des matières pour les matériaux et les numéros de catalogue.
-
Préparer des plaques de revêtement pour la culture cellulaire.
- Diluer la solution de revêtement de la matrice extracellulaire (ECM) avec médias DMEM/F12 pour préparer un 1 mg/mL solution. Aliquote l’ECM dilué dans 30 tubes coniques de 3 mL de chaque solution-mère et stocker immédiatement à-20 ° C. Pour une solution de ....
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Résultats
Lorsqu’ont été exécutés correctement, ce protocole va produire des populations définies des cocultures fonctionnelles d’astrocytes28,33,34 et neurones35 produit de hPSCs (Figure 1 a-1C), comme détaillées précédemment26 et étapes 2.1 à 2.2 décrites ici. Cette procédure pas à pas, avec l’utilisation de pl.......
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Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons une méthode systématique pour la production des sphères 3D des cocultures neuronales. Les sphères sont composées des astrocytes et les neurones, qui sont dérivées de manière indépendante de hPSCs. Bien que pas l’objectif du présent protocole, la génération des populations pures des astrocytes du hPSCs28 est une étape cruciale et peut être techniquement difficile si effectuée sans expérience préalable. Cette première étape de la génération de ces microcircuits syna.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous tenons à remercier Dr. Erik Ullian (UCSF) pour un apport intellectuel sur la conception de ces procédures, Dr Michael Ward (NIH) pour des conseils techniques sur la différenciation des rudolfinho et Saba Barlas d’analyse d’images préliminaires.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Plaque à 6 puits | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Tubes coniques de 15 mL | Olympus Plastics | 28-101 | |
| Accutase | Sigma | A6964-100ML | Solution de détachement |
| Plaque AggreWell | Stemcell Technologies | 34850 | |
| Solution de rinçage anti-adhérence | Stemcell Technologies | 7010 | Prevent cell adhérence aux plaques de micropuits |
| Anti/anti | Thermofisher | 15240062 | |
| B27 | Thermofisher | 17504044 | Media Supplément |
| Milieu neuronal BrainPhys | Stemcell Technologies | 5790 | Alternative au milieu basal neurophysiologique |
| Lamelles de verre circulaires | Neuvitro | GG-12-oz | |
| Cryostor CS10 | Stemcell Technologies | 7930 | Milieu de cryoconservation avec 10 % de DMSO |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 10565-042 | Avec supplément de GlutaMAX |
| DMH-1 | Stemcell Technologies | 73634 | DANGER : Toxique en cas d’ingestion. Concentration de travail : 2 &mu ; M |
| Sérum d’âne | Lampire Biological Laboratories | 7332100 | Concentration de travail : 5 % dans le tampon de blocage primaire, 1 % dans le tampon de blocage secondaire |
| Chlorhydrate de doxycycline (Dox) | Sigma | D3072-1ml | DANGER : Toxique pour les femmes enceintes. Concentration de travail : 2 &mu ; g/mL |
| Facteur de croissance épidermique (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Concentration de travail : 10 ng/mL |
| Facteur de croissance des fibroblastes-2 (FGF) | Peprotech | 100-18B | Concentration de travail : 10 ng/mL |
| Solution de montage Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Lames de verre | Fisherbrand | 22-037-246 | |
| Sérum | de chèvreLampire Biological Laboratories | 7332500 | Concentration de travail : 5 % dans le tampon de blocage primaire, 1 % dans le tampon de blocage secondaire |
| Hémacytomètre ou compteur automatique de cellules | Life Technologies | AMQAX1000 | |
| Heparin | Sigma | H3149-50KU | Concentration de travail : 2 mg/mL |
| Plaque magnétique | DLAB | 8030170200 | |
| Matrice membranaire Matrigel | Corning | 354230 | Solution de revêtement ECM. Concentration de travail : 80 &mu ; g/ml. Préparez-le sur de la glace et assurez-vous que les pipettes, les tubes et les supports sont pré-refroidis. |
| Système MEA 2100 | Systèmes multicanaux | MEA2100 | |
| Solution | |||
| N2 | Thermofisher | 17502048 | Media Supplement |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | Solution d’enrobage tissulaire pour la cryosection |
| Pap Pen (Aqua Hold) | Laboratoire de dispositifs scientifiques | 9804-02 | |
| Paraformaldéhyde ( PFA) | Acros Organics | 169650025 | DANGER : Toxique en cas d’inhalation. Concentration de travail : 4 % dans une |
| solution saline tamponnée au phosphate PBS (PBS) | Stemcell Technologies | CA008-300 | |
| Poly-l-ornithine (PLO) | Sigma | P3655-100MG | Concentration de travail : 0,5 mg/mL |
| Couvercles rectangulaires en verre | Fisherfinest Premium Superslip | 12-545-88 | |
| ReLeSR | Stemcell Technologies | 5872 | Détachement et passage réactif |
| Inhibiteur de la rho-kinase Y27632- (Y) | Tocris | 1254 | Concentration de travail : 10 uM |
| SB431542 | Stemcell Technologies | 72234 | Concentration de travail : 2 &mu ; M |
| Fioles tournantes | Fisher Scientific | 4500-125 | |
| Saccharose | Fisher Chemical | S5-3 | Concentration de travail : 20 % ou 30 % dans la |
| fiole de culture PBS T25 | Olympus Plastics | 25-207 | Bouchons ventilés |
| T75 Flacon de culture Olympus | Plastics | 25-209 | Bouchons ventilés |
| Terg-A-zyme | Sigma | Z273287-1EA | Détergent. Concentration de travail : 1 % |
| de milieu basal TeSR-E8 | Stemcell Technologies | 5940 | Milieu de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) |
| Suppléments TeSR-E8 Suppléments | pour le milieu de cellules souches pluripotentes humaines | ||
| TritonX-100 | Sigma | X100-500ML | Détergent pour la perméabilisation cellulaire. Concentration de travail : 0,25 % dans le tampon bloquant |
| Bleu trypan | Invitrogen | T10282 | |
| forts | |||
| AlexaFluor 488 | Thermofisher | A-11029 | Anticorps secondaire |
| AlexaFluor 594 | Thermofisher | A-11037 | Anticorps secondaires |
| Ezrin | Thermofisher | MA5-13862 | Anticorps primaires ; astrocytes périsynaptiques |
| GFAP | Chemicon | MAB360 | Anticorps primaires ; astrocytes |
| GFP | Aves | GFP-1020 | Anticorps primaire ; astrocytes |
| Glt1 | Don du Dr Jeffrey Rothstein | n/a | Anticorps primaire ; astrocytes |
| Homer | Synaptic Systems | 160 011 | Anticorps primaire ; neurones post-synaptiques |
| MAP2 | Systèmes synaptiques | 188 004 | Anticorps primaires ; neurones |
| PSD95 | Abcam | ab2723 | Anticorps primaires ; neurones post-synaptiques |
| S100 | Abcam | ab868 | Anticorps primaires ; astrocytes |
| Synapsine 1 | Systèmes synaptiques | 106 103 | Anticorps primaires ; neurones pré-synaptiques |
| TuJ1/&beta ; 3-tubuline (TUBB3) | Covance | MMS-435P | Anticorps primaire ; neurones |
Références
- Ullian, E. M., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Role for Glia in Synaptogenesis. Glia. 47, 209-216 (2004).
- Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
- Molofsky, A. V., et al.
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Réimpressions et autorisations
