ביולוגיה של התא כמותית של הקשורים ניוון מוחיים ב דרוזופילה דרך ניתוח לא משוחדת של חלבונים מתויגות Fluorescently באמצעות ImageJ
Summary
פיתחנו זרימת עבודה פשוטה וישימה לחלץ נתונים כמותיים במחקרים ביולוגיים תא המבוססות על ידי קרינה פלואורסצנטית-הדמיה של צבירת חלבון, שטף autophagic במערכת העצבים המרכזית דגמי דרוזופילה הקשורים ניוון מוחיים.
Abstract
עם עליית השכיחות של מחלות ניווניות, חשוב יותר ויותר להבין פתופיזיולוגיה כבסיס שמוביל בתפקוד עצביים ואובדן. כלי דימות מבוססות קרינה פלואורסצנטית וטכנולוגיות לאפשר ניתוח חסר תקדים של תהליכים הנוירוביולוגי subcellular, אך עדיין יש צורך גישות לא משוחדת, הדירים נגיש עבור חילוץ מידע כמיתים הדמיה מחקרים . פיתחנו זרימת עבודה פשוטה וישימה לחלץ נתונים כמותיים מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית מחקרי הדמיה באמצעות מודלים דרוזופילה הקשורים ניוון מוחיים. באופן ספציפי, אנו מתארים גישה easy-to-בצע, חצי אוטומטיות באמצעות פיג ‘ י/ImageJ לנתח שני תהליכים תאיים: קודם כל, אנחנו לכמת חלבון צבירה ותוכן הפרופיל באונה אופטיים דרוזופילה באמצעות מוטציה מתויג פלורסנט huntingtin חלבונים; שנית, נוכל להעריך autophagy-ליזוזום השטף במערכת דרוזופילה חזותית עם מבוססי רציומטרי כימות של עיתונאי פלורסנט טנדם autophagy. חשוב לציין, פרוטוקול שמפורטות כאן כולל צעד פילוח חצי אוטומטי כדי להבטיח שמבנים פלורסנט כל מנותחות כדי למזער את הטיית בחירה וכדי להגדיל את הרזולוציה של השוואות עדין. גישה זו ניתן להרחיב לניתוח של מבנים ביולוגיים אחרים תאים, תהליכים מעורבים הקשורים ניוון מוחיים, כגון puncta proteinaceous (מתח בגרגרים, מתחמי סינפטית), כמו גם כמו קרום מאוגד תאים (המיטוכונדריה, קרום. שלפוחית סחר בבני אדם). שיטה זו מספקת סטנדרטית, אך הפניה וישימה הצבע עבור ניתוח תמונות ו כמת, יכול להקל על אמינות ועל הפארמצבטית לחצות את השדה ואת בסופו של דבר לשפר את ההבנה מכניסטית של הקשורים ניוון מוחיים.
Introduction
מחלות ניווניות משפיעות על מיליוני אנשים מדי שנה ועל השכיחות עולה עם אוכלוסייה הזדקנות1. בעוד כל מחלות ניווניות יש אטיולוגיה ייחודי, צבירה של חלבונים misfolded של התמוטטות של הרשת פרוטוסטאזיס חדישים נפוצות פתולוגיים רבים של מחלות אלו. שחקרתי כיצד הפרעה של תהליכים אלה לתקצב ויסודי משתבשת לתרום למוות בתפקוד של תאים עצביים חיוני להבנת מחלות ניווניות, כמו גם המנחה התערבויות טיפוליות. דימות מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מאפשר לחקירה של תהליכים אלה מורכבים ודינאמיים בנוירונים והוא תרם רבות להבנת הביולוגיה דופאמינרגיים. ניתוח של חלבונים מתויגות fluorescently הוא מאתגר, במיוחד כאשר הניסויים מתבצעים ויוו, עקב רקמות קומפקטית מאוד, סוגי תאים שונים, והטרוגניות מורפולוגי. כימות באופן ידני בסיוע במחיר נוח ולא פשוטה, אך היא לעתים קרובות ועתירת בכפוף נטאי אנושי. לכן, אין צורך גישות לא משוחדת, הדירים נגיש עבור חילוץ מידע כמיתים הדמיה מחקרים.
אנחנו המחולקות זרימת עבודה פשוטה וישימה באמצעות פיג ‘ י/ImageJ, תמונת עוצמה ונגיש באופן חופשי עיבוד תוכנה2,3, כדי לחלץ נתונים כמותיים מלימודי הדמיה פלורסצנטיות ניסיוניות של הקשורים ניוון מוחיים באמצעות דרוזופילה. לפי פרוטוקול זה לכמת צבירת חלבון, שטף autophagic — שני תאים תכונות ביולוגיות שאינן רלוונטיות גבוהה לפתולוגיה מחלות ניווניות — להדגים את הרגישות ואת הפארמצבטית של גישה זו. ניתוח של חלבונים huntingtin מוטציה fluorescently מתויג (Htt) באונה אופטיים דרוזופילה גילה את מספר, גודל, ואת האינטנסיביות של אגרגטים חלבון. אנו דמיינו, עיתונאי פלורסנט טנדם השטף autophagic בתוך מערכת הראייה דרוזופילה , אשר מציג אותות פליטה שונים בהתאם לסביבה compartmental4. ניתוח המבוסס על רציומטרי של הכתב טנדם המותר עבור תצוגה כמותיים ומקיף של השטף autophagy-ליזוזום autophagosome היווצרות, התבגרות, תחבורה כדי השפלה ליזוזום, בנוסף מודגשות. פגיע תאים בהתנאים ניווניות. חשוב, הן בניתוח לנו ליישם סף חצי אוטומטיות והשלבים פילוח פרוטוקול שלנו כדי לצמצם הטיה לא מודעת, להגדיל את כוח דגימה, מספקות תקן כדי להקל על השוואות בין מחקרים דומים. זרימת עבודה פשוטה נועד להפוך עוצמה תוספים פיג ‘ י/ImageJ (שפותחה על ידי מדעני מחשב מבוסס על אלגוריתמים מתמטיים) נגיש יותר neurobiologists ולקהילה מדעי החיים בכללותו.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול שמפורטות כאן יכול לשמש robustly, reproducibly quantitate תא תהליכים ביולוגיים דמיינו ידי דימות מבוסס על קרינה פלואורסצנטית. ההקשר הביולוגי ומגבלות טכניות צריך להישקל בזהירות כדי להנחות הנבחנים. פלורסנט סמנים של מבנים subcellular של עניין, אם immunohistochemical, מבוסס-צבען, או ביטוי מבחינה גנטית, צריך להיות נ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי שילה דוד פואנטה נוירופתי כאב מחקר התוכנית לתואר שני לאגודה (ל J.M.B.), הבחורים החיים של האפיפיור לויס תוכנה (כדי מודיע Y.Z., J.M.B.), קרן שניידר-רובינסון לאחווה Predoctoral (כדי מודיע), ה-ד ר ג’ון T . קרן מקדונלד (כדי מודיע), חוזים, מענקים של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018 ו- R56NS095893 (R.G.Z.), ועל -ידי טאישאן מלומד לפרוייקט (מחוז שאנדונג, הרפובליקה העממית של סין) (R.G.Z.).
Materials
| SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | PF184250 | Dissection dish |
| Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish | Corning | 351008 | Dissection dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dissection tool |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | PBS solution |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | PBS solution |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P5655 | PBS solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Washing and antibody incubaton solution. |
| 37% Formaldehyde | VWR | 10790-710 | Fixation |
| Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue) | VWR | 89000-022 | Fixation, washing, and antibody incubaton. |
| Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm) | VWR | 48312-004 | Slides for confocal imaging |
| Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm) | VWR | 48393-172 | Slides for confocal imaging |
| Rubber Cement | Slime | 1051-A | Mounting |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting |
| Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m) | 3M Company | 810 | Mounting |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Antibody incubaton |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx. |
| 3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope | AmScope | SM-1BNZ | Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.51u | With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2) |
| FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Recombinant Construct | Bloomington Drosophila Stock Center | BL37749 |
References
- Erkkinen, M. G., Kim, M. -. O., Geschwind, M. D. Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases. Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671 (2012).
- Mauvezin, C., Ayala, C., Braden, C. R., Kim, J., Neufeld, T. P. Assays to monitor autophagy in Drosophila. Methods. 68 (1), 134-139 (2014).
- Weiss, K. R., Kimura, Y., Lee, W. -. C. M., Littleton, J. T. Huntingtin aggregation kinetics and their pathological role in a Drosophila Huntington’s disease model. Génétique. 190 (2), 581-600 (2012).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (39), E5427-E5433 (2015).
- DeVorkin, L., Gorski, S. M. Monitoring autophagy in Drosophila using fluorescent reporters in the UAS-GAL4 system. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (9), (2014).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of visualized experiments: JoVE. (37), (2010).
- Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2011).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neurosciences. 24 (5), 251-254 (2001).
- Fischbach, K. -. F., Dittrich, A. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and tissue research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Ruan, K., Zhu, Y., Li, C., Brazill, J. M., Zhai, R. G. Alternative splicing of Drosophila Nmnat functions as a switch to enhance neuroprotection under stress. Nature Communications. 6, 10057 (2015).
- Zhai, R. G., et al. NAD synthase NMNAT acts as a chaperone to protect against neurodegeneration. Nature. 452 (7189), 887 (2008).
- Li, C., et al. Spermine synthase deficiency causes lysosomal dysfunction and oxidative stress in models of Snyder-Robinson syndrome. Nat Commun. 8 (1), 1257 (2017).
- Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. Development and structure of synaptic contacts in Drosophila. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).
- Maday, S., Holzbaur, E. L. Autophagosome biogenesis in primary neurons follows an ordered and spatially regulated pathway. Dev Cell. 30 (1), 71-85 (2014).
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Molecular biology of the cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
- Lee, S., Sato, Y., Nixon, R. A. Primary lysosomal dysfunction causes cargo-specific deficits of axonal transport leading to Alzheimer-like neuritic dystrophy. Autophagy. 7 (12), 1562-1563 (2011).
- Vincent, L., Soille, P. Watersheds in digital spaces: an efficient algorithm based on immersion simulations. IEEE Transactions on Pattern Analysis & Machine Intelligence. (6), 583-598 (1991).
- Najman, L., Schmitt, M. Geodesic saliency of watershed contours and hierarchical segmentation. IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence. 18 (12), 1163-1173 (1996).
- Shiber, A., Breuer, W., Ravid, T. Flow cytometric quantification and characterization of intracellular protein aggregates in yeast. Prion. 8 (3), 276-284 (2014).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).
