Kvantitativ cellebiologi mentalt tilbakestående da i Drosophila gjennom objektiv analyse av Fluorescently merket proteiner med ImageJ
Summary
Vi har utviklet en enkel og tilpasningsdyktig arbeidsflyt for å trekke ut kvantitative data fra fluorescens-imaging-baserte celle biologiske studier av protein aggregering og autophagic forandring i sentralnervesystemet Drosophila modeller av neurodegeneration.
Abstract
Med økende utbredelsen av nevrodegenerative sykdommer er det stadig viktigere å forstå de underliggende patofysiologien som fører til nevronale dysfunksjon og tap. Fluorescens-basert bildebehandling verktøy og teknologier aktiverer enestående analyse av subcellular nevrobiologiske prosesser, men det er fortsatt behov for objektivt reproduserbare og tilgjengelige metoder for utpakking kvantifiserbare data fra imaging studier . Vi har utviklet en enkel og tilpasningsdyktig arbeidsflyt for å trekke ut kvantitative data fra fluorescens-baserte imaging studier med Drosophila modeller av neurodegeneration. Spesielt vi beskrive en lett-å-følge, semi-automatisert tilnærming med Fiji/ImageJ analysere to cellulære prosesser: først, vi kvantifisere samlet proteininnhold og profilen i Drosophila optikk flik med fluorescerende-merket mutant huntingtin proteiner; og andre, vi vurdere autophagy-lysosome forandring i Drosophila visuelle systemet med ratiometric-baserte kvantifisering av tandem fluorescerende reporter for autophagy. Viktigere, inkluderer protokollen skissert her et semi-automatisert segmentering skritt for å sikre alle fluorescerende strukturer analyseres å minimere utvalget bias og å øke oppløsningen til subtile sammenligninger. Denne tilnærmingen kan utvides for analyse av andre cellen biologiske strukturer og prosesser innblandet i neurodegeneration, som proteinaceous puncta (stress granulater og synaptic komplekser), så vel som membran-bundet rom (mitokondrier og membran menneskehandel blemmer). Denne metoden gir et standardisert, men tilpasningsdyktige referanse for bildeanalyse og kvantifisering, og kunne lette pålitelighet og reproduserbarhet over feltet, og til slutt øke mekanistisk forståelse av neurodegeneration.
Introduction
Nevrodegenerative sykdommer påvirker millioner av mennesker hvert år og forekomsten øker med en aldrende befolkning1. Mens hver nevrodegenerative sykdommer har en unik etiologi, er samling av misfolded proteiner og nedbryting av proteostasis nettverket vanlige patologisk kjennemerkene til mange av disse sykdommene. Klargjørende hvordan forstyrrelse av prosessene grunnleggende og beslektede går galt er å bidra til nevronale dysfunksjon og celle død avgjørende for forstå nevrodegenerative sykdommer, samt guiding terapeutisk intervensjon. Fluorescens-basert bildebehandling tillater undersøkelse av disse komplekse og dynamiske prosesser i nerveceller og har sterkt bidratt til vår forståelse av neuronal cellebiologi. Analyse av fluorescently merket proteiner er utfordrende, spesielt når eksperimenter utføres i vivo, svært kompakt vev, ulike celletyper, og morfologiske heterogenitet. Manuelt assistert kvantifisering er rimelig og enkelt, men er ofte tidkrevende og utsatt for menneskelig bias. Derfor er det behov for objektivt reproduserbare og tilgjengelige metoder for utpakking kvantifiserbare data fra imaging studier.
Vi har skissert en enkel og tilpasningsdyktig arbeidsflyt ved hjelp av Fiji/ImageJ, en kraftig og fritt tilgjengelig bildebehandling programvare2,3, trekke ut kvantitative data fra fluorescens tenkelig studier i eksperimentelle modeller av neurodegeneration bruker Drosophila. Ved å følge denne protokollen for å kvantifisere protein aggregering og autophagic flux-to celle biologiske egenskaper som er svært relevante for nevrodegenerative sykdommer patologi-vi viste den sensitivitet og reproduserbarhet av denne tilnærmingen. Analyse av fluorescently merket mutant huntingtin (Htt) proteiner i Drosophila optikk flik avdekket antall, størrelse og intensitet av protein aggregater. Vi visualisert tandem fluorescerende reporter av autophagic forandring i Drosophila visuelle systemet, som viser forskjellige utslipp signaler avhengig av avdelingsflytting miljø4. Ratiometric-basert analyse av tandem reporteren tillatt for en kvantitativ og omfattende utsikt over autophagy-lysosome flux fra autophagosome formasjon, modning og transport til degradering av lysosome, og i tillegg markert sårbare rom forstyrret i neurodegenerative forhold. Viktigere, i begge analyser vi implementert halvautomatisk terskelverdi og segmentering skritt i våre protokollen å minimere ubevisst bias, øke prøvetaking makt og gir en standard for å forenkle sammenligninger mellom lignende studier. Grei arbeidsflyten er ment å gjøre kraftige Fiji/ImageJ plugins (utviklet ved datamaskinen forskere basert på matematiske algoritmer) mer tilgjengelig for neurobiologists og biovitenskap samfunnet generelt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen skissert her kan brukes å robust og reproduserbar quantitate celle biologiske prosesser visualisert ved fluorescens-basert bildebehandling. Biologisk sammenheng og tekniske begrensninger må nøye vurderes å veilede eksperimentell design. Fluorescerende markører av subcellular strukturer rundt, om immunohistochemical, fargebasert eller genetisk uttrykt, må være gjenkjennelig over bakgrunnen av morfologi og intensitet. UAS/GAL4 systemet er mye brukt til å drive målrettet genuttrykk i Drosop…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet er støttet av Sheila og David Fuente nevropatisk smerte Research Program Graduate Fellowship (til J.M.B.), Lois Pope LIFE Fellows programmet (til CL, Y.Z. og J.M.B.), Snyder-Robinson Foundation Predoctoral fellesskap (til CL), Dr. John T . Macdonald Foundation (som CL), kontrakter, tilskudd fra National Institutes of Health (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018 og R56NS095893 (til R.G.Z.), og av Taishan Scholar Project (Shandong provinsen, Folkerepublikken Kina) (til R.G.Z.).
Materials
| SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | PF184250 | Dissection dish |
| Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish | Corning | 351008 | Dissection dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dissection tool |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | PBS solution |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | PBS solution |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P5655 | PBS solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Washing and antibody incubaton solution. |
| 37% Formaldehyde | VWR | 10790-710 | Fixation |
| Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue) | VWR | 89000-022 | Fixation, washing, and antibody incubaton. |
| Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm) | VWR | 48312-004 | Slides for confocal imaging |
| Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm) | VWR | 48393-172 | Slides for confocal imaging |
| Rubber Cement | Slime | 1051-A | Mounting |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting |
| Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m) | 3M Company | 810 | Mounting |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Antibody incubaton |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx. |
| 3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope | AmScope | SM-1BNZ | Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.51u | With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2) |
| FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Recombinant Construct | Bloomington Drosophila Stock Center | BL37749 |
References
- Erkkinen, M. G., Kim, M. -. O., Geschwind, M. D. Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases. Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671 (2012).
- Mauvezin, C., Ayala, C., Braden, C. R., Kim, J., Neufeld, T. P. Assays to monitor autophagy in Drosophila. Methods. 68 (1), 134-139 (2014).
- Weiss, K. R., Kimura, Y., Lee, W. -. C. M., Littleton, J. T. Huntingtin aggregation kinetics and their pathological role in a Drosophila Huntington’s disease model. Génétique. 190 (2), 581-600 (2012).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (39), E5427-E5433 (2015).
- DeVorkin, L., Gorski, S. M. Monitoring autophagy in Drosophila using fluorescent reporters in the UAS-GAL4 system. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (9), (2014).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of visualized experiments: JoVE. (37), (2010).
- Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2011).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neurosciences. 24 (5), 251-254 (2001).
- Fischbach, K. -. F., Dittrich, A. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and tissue research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Ruan, K., Zhu, Y., Li, C., Brazill, J. M., Zhai, R. G. Alternative splicing of Drosophila Nmnat functions as a switch to enhance neuroprotection under stress. Nature Communications. 6, 10057 (2015).
- Zhai, R. G., et al. NAD synthase NMNAT acts as a chaperone to protect against neurodegeneration. Nature. 452 (7189), 887 (2008).
- Li, C., et al. Spermine synthase deficiency causes lysosomal dysfunction and oxidative stress in models of Snyder-Robinson syndrome. Nat Commun. 8 (1), 1257 (2017).
- Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. Development and structure of synaptic contacts in Drosophila. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).
- Maday, S., Holzbaur, E. L. Autophagosome biogenesis in primary neurons follows an ordered and spatially regulated pathway. Dev Cell. 30 (1), 71-85 (2014).
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Molecular biology of the cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
- Lee, S., Sato, Y., Nixon, R. A. Primary lysosomal dysfunction causes cargo-specific deficits of axonal transport leading to Alzheimer-like neuritic dystrophy. Autophagy. 7 (12), 1562-1563 (2011).
- Vincent, L., Soille, P. Watersheds in digital spaces: an efficient algorithm based on immersion simulations. IEEE Transactions on Pattern Analysis & Machine Intelligence. (6), 583-598 (1991).
- Najman, L., Schmitt, M. Geodesic saliency of watershed contours and hierarchical segmentation. IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence. 18 (12), 1163-1173 (1996).
- Shiber, A., Breuer, W., Ravid, T. Flow cytometric quantification and characterization of intracellular protein aggregates in yeast. Prion. 8 (3), 276-284 (2014).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).
