Biologia celular quantitativa de neurodegeneração em Drosophila , através de uma análise imparcial das proteínas fluorescente etiquetadas usando o ImageJ
Summary
Nós desenvolvemos um fluxo de trabalho simples e adaptável para extrair dados quantitativos de estudos biológicos fluorescência-imagem latente-à base de célula de agregação de proteínas e autophagic fluxo no sistema nervoso central de Drosophila modelos de Neurodegeneração.
Abstract
Com a crescente prevalência de doenças neurodegenerativas, é cada vez mais importante entender a fisiopatologia subjacente que leva à perda e disfunção neuronal. Tecnologias e ferramentas de imagem baseada em fluorescência permitem uma análise sem precedentes dos processos neurobiológicos subcellular, no entanto, há ainda a necessidade de abordagens imparciais, reprodutíveis e acessíveis para extrair dados quantificáveis de estudos de imagem . Nós desenvolvemos um fluxo de trabalho simples e adaptável para extrair dados quantitativos de estudos de imagens baseada em fluorescência usando modelos da drosófila de neurodegeneração. Especificamente, nós descrevemos uma abordagem fácil de seguir, semi automatizada usando Fiji/ImageJ para analisar dois processos celulares: em primeiro lugar, podemos quantificar agregar conteúdo de proteína e perfil no lobo óptico drosófila usando fluorescente-tag mutante huntingtina proteínas; e em segundo lugar, avaliamos o fluxo de autofagia-lisossoma no sistema visual de drosófila com quantificação baseada em ratiometric de um repórter fluorescentes em tandem de autofagia. Importante, o protocolo descrito aqui inclui uma etapa de segmentação semi-automática para garantir que todas as estruturas fluorescentes são analisadas para minimizar o viés de seleção e aumentar a resolução de comparações sutis. Esta abordagem pode ser estendida para a análise de outras estruturas biológicas celulares e processos implicados na neurodegeneração, tais como partitura proteicas (grânulos de stress e complexos sinápticos), compartimentos, bem como membrana-limite (mitocôndrias e vesículas de tráfico de membrana). Este método oferece uma forma padronizada, ainda referência adaptável aponte para análise de imagens e quantificação e poderia facilitar a confiabilidade e reprodutibilidade através do campo e, finalmente, melhorar a compreensão mecanicista da neurodegeneração.
Introduction
Doenças neurodegenerativas afectam milhões de pessoas a cada ano e a incidência está aumentando com uma população de envelhecimento1. Enquanto cada doença neurodegenerativa tem uma única etiologia, agregação de misfolded proteínas e desagregação da rede proteostasis são comuns características patológicas muitas destas doenças. Elucidar como interrupção destes processos fundamentais e inter-relacionados dá errado contribuir para a morte neuronal de disfunção e célula é fundamental para o entendimento das doenças neurodegenerativas, bem como orientar intervenções terapêuticas. Geração de imagens baseada em fluorescência permite a investigação destes processos complexos e dinâmicos em neurônios e contribuiu enormemente para a nossa compreensão da biologia celular neuronal. Análise de proteínas fluorescente etiquetadas é um desafio, especialmente quando são realizados experimentos na vivo, devido à heterogeneidade morfológica, tipos de diversas células e tecidos altamente compactos. Quantificação manualmente assistida é acessível e simples, mas muitas vezes é demorado e sujeito a viés humano. Portanto, há uma necessidade de abordagens imparciais, reprodutíveis e acessíveis para extrair dados quantificáveis de estudos de imagem.
Nós esboçamos um fluxo de trabalho simples e adaptável usando Fiji/ImageJ, uma software de2,3, de processamento de imagem poderosa e livremente acessível para extrair dados quantitativos de estudos de imagiologia de fluorescência em modelos experimentais de Neurodegeneração utilizando drosófila. Seguindo este protocolo para quantificar a agregação da proteína e fluxo autophagic — duas células características biológicas que são altamente relevantes para a patologia de doenças neurodegenerativas — temos demonstrado a sensibilidade e a reprodutibilidade desta abordagem. Análise de proteínas fluorescente etiquetado huntingtina mutante (Htt) no lobo óptico Drosophila revelou o número, tamanho e intensidade de agregados de proteínas. Nós visualizado um repórter fluorescentes em tandem de autophagic fluxo dentro do sistema visual de Drosophila , que exibe sinais de emissão diferentes dependendo do ambiente compartimental4. Análise baseada em Ratiometric do repórter em tandem permitiu uma visão quantitativa e abrangente de fluxo de autofagia-lisossoma do autophagosome de formação, maturação e transporte para a degradação do lisossomo e adicionalmente destacou vulneráveis compartimentos interrompidos em condições neurodegenerativas. Importante, em ambas as análises implementamos limiarização semi-automático e passos de segmentação em nosso protocolo para minimizar o preconceito inconsciente, aumentar o poder de amostragem e fornecer um padrão para facilitar comparações entre estudos semelhantes. O fluxo de trabalho simples destina-se a fazer poderosos plugins de Fiji/ImageJ (desenvolvido por cientistas de computador baseados em algoritmos matemáticos) mais acessível a neurobiologia isto e a comunidade de Ciências da vida em geral.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito aqui pode ser usado de forma robusta e reproducibly dosar processos biológicos de célula visualizados pela geração de imagens baseada em fluorescência. Contexto biológico e limitações técnicas precisam ser cuidadosamente considerados para guiar o projeto experimental. Marcadores fluorescentes de estruturas subcelulares de interesse, se imuno-histoquímica, à base de corantes, ou geneticamente expressa, precisa ser distinguíveis acima fundo pela morfologia e intensidade. O sistema UAS/G…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pela Sheila e David Fuente neuropática dor programa de pós-graduação bolsa de pesquisa (para J.M.B.), a Lois Pope LIFE Fellows programa (de C.L., Y.Z. e J.M.B.), o Snyder-Robinson Foundation Fellowship Predoctoral (para CL), o Dr. John T . MacDonald Foundation (CL), contratos, subvenções de institutos nacionais de saúde (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018 e R56NS095893 (para R.G.Z.) e pelo projeto de estudioso de Taishan (província de Shandong, República Popular da China) (para R.G.Z.).
Materials
| SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | PF184250 | Dissection dish |
| Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish | Corning | 351008 | Dissection dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dissection tool |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | PBS solution |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | PBS solution |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P5655 | PBS solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Washing and antibody incubaton solution. |
| 37% Formaldehyde | VWR | 10790-710 | Fixation |
| Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue) | VWR | 89000-022 | Fixation, washing, and antibody incubaton. |
| Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm) | VWR | 48312-004 | Slides for confocal imaging |
| Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm) | VWR | 48393-172 | Slides for confocal imaging |
| Rubber Cement | Slime | 1051-A | Mounting |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting |
| Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m) | 3M Company | 810 | Mounting |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Antibody incubaton |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx. |
| 3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope | AmScope | SM-1BNZ | Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.51u | With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2) |
| FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Recombinant Construct | Bloomington Drosophila Stock Center | BL37749 |
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