Kvantitativa cellbiologi för Neurodegeneration i Drosophila genom förutsättningslös analys av Fluorescently märkta proteiner med hjälp av ImageJ
Summary
Vi har utvecklat en enkel och anpassningsbar arbetsflöde för att extrahera kvantitativ data från fluorescens-imaging-baserade cell biologiska studier av protein aggregering och autophagic flux i det centrala nervsystemet Drosophila modeller av neurodegeneration.
Abstract
Med den ökande förekomsten av neurodegenerativa sjukdomar är det allt viktigare att förstå underliggande patofysiologin som leder till neuronal dysfunktion och förlust. Fluorescens-baserat imaging verktyg och tekniker möjliggör oöverträffad analys av subcellulär neurobiologiska processer, ändå finns det fortfarande ett behov av opartisk, reproducerbar och tillgängliga metoder för att extrahera kvantifierbara data från studier avbildning . Vi har utvecklat en enkel och anpassningsbar arbetsflöde för att extrahera kvantitativ data från fluorescens-baserat imaging studier Drosophila modeller av neurodegeneration. Specifikt, beskriver vi en lätt att följa, halvautomatisk metod med Fiji/ImageJ för att analysera två cellulära processer: först, vi kvantifiera sammanlagda proteinhalten och profil i den Drosophila optic LOB med lysrör-taggade mutant huntingtin protein; och för det andra, vi bedöma autofagi-Lysosomen flux i Drosophila visuella systemet med proportionerlig-baserade kvantifiering av tandem fluorescerande reporter av autofagi. Ännu viktigare, innehåller protokollet beskrivs här ett halvautomatiskt segmentering steg för att säkerställa alla fluorescerande strukturer analyseras att minimera urval bias och öka upplösning av subtila jämförelser. Detta tillvägagångssätt kan förlängas för analys av andra cell biologiska strukturer och processer inblandad i neurodegeneration, såsom proteinhaltiga puncta (stressgranula och synaptic komplex), samt som membran-bundna fack (mitokondrier och membranet människohandel blåsor). Denna metod ger en standardiserad, men anpassningsbar referenspunkt för bildanalys och kvantifiering, och kunde underlätta pålitlighet och reproducerbarhet över fältet, och som i slutändan förbättra mekanistisk förståelse av neurodegeneration.
Introduction
Neurodegenerativa sjukdomar drabbar miljontals människor varje år och incidensen ökar med en åldrande befolkning1. Medan varje neurodegenerativ sjukdom har en unik etiologi, är aggregering av felveckning proteiner och uppdelning av proteostasis nätverket gemensamma patologiska kännetecken för många av dessa sjukdomar. Belysa hur störningar av dessa grundläggande och inbördes relaterade processer går snett är för att bidra till neuronal dysfunktion och cell död kritisk för förståelse neurodegenerativa sjukdomar samt vägledande terapeutiska interventioner. Fluorescens-baserat imaging möjliggör undersökning av dessa komplexa och dynamiska processer i nervceller och har starkt bidragit till vår förståelse av neuronala cellbiologi. Analys av fluorescently märkta proteiner är utmanande, särskilt när experimenten utförs i vivo, på grund av mycket kompakta vävnader, olika celltyper och morfologiska heterogenitet. Manuellt assisterad kvantifiering är prisvärda och enkla, men är ofta tidskrävande och föremål för mänsklig partiskhet. Därför finns det ett behov av opartisk, reproducerbar och tillgängliga metoder för att extrahera kvantifierbara data från studier avbildning.
Vi har sammanställt en enkel och anpassningsbar arbetsflöden med Fiji/ImageJ, en kraftfull och fritt tillgängliga bildbehandling programvara2,3, extrahera kvantitativ data från fluorescens imaging studier i experimentella modeller av neurodegeneration använda Drosophila. Genom att följa detta protokoll för att kvantifiera protein aggregering och autophagic flux — två cell biologiska funktioner som är mycket relevanta för neurodegenerativa sjukdomen patologi — vi visat känslighet och reproducerbarhet av detta synsätt. Analysen av fluorescently märkta muterade huntingtin (Htt) proteiner i den Drosophila optic loben visade antal, storlek och intensitet av protein aggregat. Vi visualiserat en tandem fluorescerande reporter på autophagic flux i Drosophila visuella system, som visar olika utsläpp signaler beroende på den compartmental miljö4. Proportionerlig-baserad analys av tandem reporter tillåtet för en kvantitativ och heltäckande bild av autofagi-Lysosomen flux från autophagosome bildning, mognad och transport till nedbrytning i lysosomen, och dessutom markeras utsatta fack störs i neurodegenerativa sjukdomar. Ännu viktigare, i båda analyser genomfört vi semi automatiserade tröskelvärde och segmentering steg i våra protokoll till minimera omedvetna fördomar, öka provtagning makt och ger en standard för att underlätta jämförelser mellan liknande studier. Det enkla arbetsflödet är avsedd att göra kraftfulla Fiji/ImageJ plugins (utvecklat av datavetare som baseras på matematiska algoritmer) mer tillgängliga för neurobiologists och biovetenskap samhället i stort.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som beskrivs här kan användas för att kraftfullt och reproducibly kvantifiera cell biologiska processer visualiseras av fluorescens-baserad avbildning. Biologiska sammanhang och tekniska begränsningar måste övervägas noggrant vägleda experimentell design. Fluorescerande markörer av subcellulära strukturer av intresse, oavsett om immunhistokemisk, färgämnet-baserade eller genetiskt uttryckt, måste vara åtskiljbar ovan bakgrund av morfologi och intensitet. UAS/GAL4 systemet är allmänt a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av Sheila och David Fuente neuropatisk smärta forskning Program Graduate Fellowship (till J.M.B.), Lois Pope LIFE Fellows Program (att C.L., Y.Z. och J.M.B.), Snyder-Robinson Foundation pre gemenskap (till C.L.), Dr John T . Macdonald Foundation (till C.L.), kontrakt, anslag från National Institutes of Health (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018 och R56NS095893 (till R.G.Z.), och av Taishan Scholar projekt (Shandong-provinsen, Folkrepubliken Kina) (till R.G.Z.).
Materials
| SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | PF184250 | Dissection dish |
| Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish | Corning | 351008 | Dissection dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dissection tool |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | PBS solution |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | PBS solution |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P5655 | PBS solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Washing and antibody incubaton solution. |
| 37% Formaldehyde | VWR | 10790-710 | Fixation |
| Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue) | VWR | 89000-022 | Fixation, washing, and antibody incubaton. |
| Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm) | VWR | 48312-004 | Slides for confocal imaging |
| Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm) | VWR | 48393-172 | Slides for confocal imaging |
| Rubber Cement | Slime | 1051-A | Mounting |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting |
| Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m) | 3M Company | 810 | Mounting |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Antibody incubaton |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx. |
| 3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope | AmScope | SM-1BNZ | Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.51u | With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2) |
| FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Recombinant Construct | Bloomington Drosophila Stock Center | BL37749 |
References
- Erkkinen, M. G., Kim, M. -. O., Geschwind, M. D. Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases. Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671 (2012).
- Mauvezin, C., Ayala, C., Braden, C. R., Kim, J., Neufeld, T. P. Assays to monitor autophagy in Drosophila. Methods. 68 (1), 134-139 (2014).
- Weiss, K. R., Kimura, Y., Lee, W. -. C. M., Littleton, J. T. Huntingtin aggregation kinetics and their pathological role in a Drosophila Huntington’s disease model. Génétique. 190 (2), 581-600 (2012).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (39), E5427-E5433 (2015).
- DeVorkin, L., Gorski, S. M. Monitoring autophagy in Drosophila using fluorescent reporters in the UAS-GAL4 system. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (9), (2014).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of visualized experiments: JoVE. (37), (2010).
- Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2011).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neurosciences. 24 (5), 251-254 (2001).
- Fischbach, K. -. F., Dittrich, A. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and tissue research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Ruan, K., Zhu, Y., Li, C., Brazill, J. M., Zhai, R. G. Alternative splicing of Drosophila Nmnat functions as a switch to enhance neuroprotection under stress. Nature Communications. 6, 10057 (2015).
- Zhai, R. G., et al. NAD synthase NMNAT acts as a chaperone to protect against neurodegeneration. Nature. 452 (7189), 887 (2008).
- Li, C., et al. Spermine synthase deficiency causes lysosomal dysfunction and oxidative stress in models of Snyder-Robinson syndrome. Nat Commun. 8 (1), 1257 (2017).
- Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. Development and structure of synaptic contacts in Drosophila. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).
- Maday, S., Holzbaur, E. L. Autophagosome biogenesis in primary neurons follows an ordered and spatially regulated pathway. Dev Cell. 30 (1), 71-85 (2014).
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Molecular biology of the cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
- Lee, S., Sato, Y., Nixon, R. A. Primary lysosomal dysfunction causes cargo-specific deficits of axonal transport leading to Alzheimer-like neuritic dystrophy. Autophagy. 7 (12), 1562-1563 (2011).
- Vincent, L., Soille, P. Watersheds in digital spaces: an efficient algorithm based on immersion simulations. IEEE Transactions on Pattern Analysis & Machine Intelligence. (6), 583-598 (1991).
- Najman, L., Schmitt, M. Geodesic saliency of watershed contours and hierarchical segmentation. IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence. 18 (12), 1163-1173 (1996).
- Shiber, A., Breuer, W., Ravid, T. Flow cytometric quantification and characterization of intracellular protein aggregates in yeast. Prion. 8 (3), 276-284 (2014).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).
