Ateş Drosophila ImageJ kullanarak Fluorescently Tagged proteinlerin tarafsız analizi ile yılında niceliksel hücre biyolojisi
Summary
Protein toplama ve merkezi sinir sistemi Drosophila modellerinin autophagic akı floresan-görüntüleme tabanlı cep biyolojik çalışmalar nicel veri ayıklamak için bir basit ve uyarlanabilir iş akışı geliştirdiğimiz ateş.
Abstract
Nörodejeneratif hastalıklar yükselen ve yaygınlığı ile giderek nöronal fonksiyon bozukluğu ve kaybına yol açan temel patofizyolojisi anlamak önemlidir. Henüz hala bir ihtiyaç için çalışmalar Imaging ölçülebilir veri ayıklamak için tarafsız, tekrarlanabilir ve erişilebilir yaklaşımlar floresans tabanlı görüntüleme araçları ve teknolojileri hücre altı nörobiyolojik süreçleri, benzeri görülmemiş analizini etkinleştirmek . Biz ateş Drosophila modelleri kullanarak floresans tabanlı görüntüleme çalışmaları sayısal veri ayıklamak için basit ve uyarlanabilir bir iş akışı geliştirdik. Özellikle, biz iki hücresel süreçler analiz etmek için Fiji/ImageJ kullanarak takip etmek kolay, yarı otomatik bir yaklaşımı açıklamak: ilk olarak, protein toplama içeriği ve profil Drosophila optik mutant floresan öğesini kullanarak lob ölçmek huntingtin proteinleri; ve ikincisi, Drosophila görsel sisteminde autophagy ratiometric tabanlı miktar bir tandem floresan gazeteci ile autophagy-lysosome akı değerlendirmek. Önemlisi, burada özetlenen iletişim kuralı tüm floresan yapıları seçim önyargı en aza indirmek için ve ince karşılaştırma çözünürlüğünü artırmak için analiz edilir emin olmak için bir yarı otomatik bölümleme adım içerir. Bu yaklaşım diğer hücre biyolojik yapıları analiz için uzatılabilir ve süreçleri de gibi membran bağlı bölmeleri içinde ateş, proteinaceous puncta (stres granül ve sinaptik kompleksleri), gibi karıştığı (mitokondri ve membran kaçakçılığı veziküller). Bu yöntem uyarlanabilir görüntü analizi ve miktar ve başvuru noktası ve güvenilirlik ve tekrarlanabilirlik alanın karşısındaki kolaylaştırmak, sonuçta ateş mekanik anlayışı geliştirmek henüz standart, sağlar.
Introduction
Nörodejeneratif hastalıklar her yıl milyonlarca insan etkiler ve bir yaşlanma nüfus1ile görülme sıklığı artmaktadır. Her nörodejeneratif hastalık benzersiz bir etiyoloji olsa da, toplama misfolded proteinlerin ve proteostasis ağ arıza bu hastalıkların çoğunun ortak patolojik işaretlerinden vardır. Nasıl bu temel ve birbiriyle ilişkili işlemler bozulma goes awry elucidating nöronal fonksiyon bozukluğu ve hücre ölümüne katkıda nörodejeneratif hastalıkları anlamak için hem de tedavi müdahaleler rehberlik çok önemlidir. Floresans tabanlı görüntüleme nöronlar karmaşık ve dinamik bu işlemlerde incelenmesi için izin verir ve büyük ölçüde nöronal hücre biyoloji anlayışımız katkıda bulunmuştur. Özellikle deneyler vivo içindeson derece kompakt doku, farklı hücre tipleri ve morfolojik heterojenite nedeniyle dışarı taşırlarken analiz fluorescently tagged proteinlerin zordur. El ile destekli miktar uygun fiyatlı ve basit, ama genellikle zaman alıcı ve tabi insan önyargı. Bu nedenle, çalışmalar Imaging ölçülebilir veri ayıklamak için tarafsız, tekrarlanabilir ve erişilebilir yaklaşımlar için bir ihtiyaç vardır.
Biz Fiji/ImageJ, güçlü ve serbestçe erişilebilir görüntü işleme yazılımı2,3, deneysel modelleri floresans görüntüleme çalışmaları nicel veri ayıklamak için kullanan basit ve uyarlanabilir bir iş akışı belirttiğimiz Drosophilakullanma ateş. Protein toplama ve autophagic akı ölçmek için bu iletişim kurallarını izleyerek — iki nörodejeneratif hastalık patolojiye son derece alakalı biyolojik özellikleri hücre — hassasiyet ve tekrarlanabilirlik bu yaklaşımın gösterdi. Drosophila optik lob fluorescently tagged mutant huntingtin (Htt) proteinlerin çözümleme sayısı, boyutu ve yoğunluğu protein toplamları ortaya. Tandem floresan muhabir autophagic akı compartmental çevre4bağlı olarak farklı emisyon sinyallerini görüntüler Drosophila görsel sistemi içinde görüntülenir. Ratiometric tabanlı analiz tandem muhabir autophagosome oluşumu, olgunlaşma ve taşıma autophagy-lysosome akı lysosome bozulması için nicel ve kapsamlı bir görünümünü için izin ve ayrıca savunmasız vurgulanmış nörodejeneratif koşullarda kesintiye bölmeleri. Önemlisi, biz bilinçsiz önyargı en aza indirmek için bizim protokolünde yarı otomatik eşik ve segmentasyon adımları hayata her iki analizlerde örnekleme gücünü artırmak ve benzer çalışmalar arasında karşılaştırma yapmayı kolaylaştırmak için bir standart sağlamak. Basit iş akışı güçlü Fiji/ImageJ eklentileri (matematik algoritmalarına dayalı bilgisayar mühendisleri tarafından geliştirilen) yapmak için tasarlanmıştır daha neurobiologists ve geniş yaşam bilimleri topluluğu için erişilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada özetlenen Protokolü sağlam ve tekrarlanarak hücre biyolojik süreçlerin floresans tabanlı görüntüleme tarafından görüntülenmiştir quantitate için kullanılabilir. Biyolojik bağlam ve teknik sınırlamalar deneysel tasarım kılavuzunu dikkatle dikkate alınması gerekir. İlgi, hücre altı yapıları floresan işaretleri immunohistokimyasal, boya tabanlı veya genetik olarak ifade edilen, Morfoloji ve yoğunluğu tarafından arka plan üzerinde ayırt olmak gerekmediğini. UAS/GAL4 sistem…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Sheila ve David Fuente Nöropatik ağrı araştırma programı yüksek lisans bursu (için J.M.B.) tarafından desteklenmektedir, Lois Pope LIFE Fellows programı (CL, Y.Z. ve J.M.B. için) Snyder-Robinson Vakfı HGUGM Bursu (için CL), Dr. John T . Macdonald Vakfı (na CL), (için R.G.Z.), Ulusal Enstitüleri (NIH) sağlık HHSN268201300038C, R21GM119018 ve R56NS095893 gelen hibe sözleşmeleri ve Taishan bilim adamı projeye (Shandong Eyaleti, Çin Halk Cumhuriyeti) (R.G.Z.) tarafından.
Materials
| SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | PF184250 | Dissection dish |
| Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish | Corning | 351008 | Dissection dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dissection tool |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | PBS solution |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | PBS solution |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P5655 | PBS solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Washing and antibody incubaton solution. |
| 37% Formaldehyde | VWR | 10790-710 | Fixation |
| Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue) | VWR | 89000-022 | Fixation, washing, and antibody incubaton. |
| Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm) | VWR | 48312-004 | Slides for confocal imaging |
| Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm) | VWR | 48393-172 | Slides for confocal imaging |
| Rubber Cement | Slime | 1051-A | Mounting |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting |
| Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m) | 3M Company | 810 | Mounting |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Antibody incubaton |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx. |
| 3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope | AmScope | SM-1BNZ | Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.51u | With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2) |
| FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Recombinant Construct | Bloomington Drosophila Stock Center | BL37749 |
References
- Erkkinen, M. G., Kim, M. -. O., Geschwind, M. D. Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases. Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671 (2012).
- Mauvezin, C., Ayala, C., Braden, C. R., Kim, J., Neufeld, T. P. Assays to monitor autophagy in Drosophila. Methods. 68 (1), 134-139 (2014).
- Weiss, K. R., Kimura, Y., Lee, W. -. C. M., Littleton, J. T. Huntingtin aggregation kinetics and their pathological role in a Drosophila Huntington’s disease model. Génétique. 190 (2), 581-600 (2012).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (39), E5427-E5433 (2015).
- DeVorkin, L., Gorski, S. M. Monitoring autophagy in Drosophila using fluorescent reporters in the UAS-GAL4 system. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (9), (2014).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of visualized experiments: JoVE. (37), (2010).
- Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2011).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neurosciences. 24 (5), 251-254 (2001).
- Fischbach, K. -. F., Dittrich, A. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and tissue research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Ruan, K., Zhu, Y., Li, C., Brazill, J. M., Zhai, R. G. Alternative splicing of Drosophila Nmnat functions as a switch to enhance neuroprotection under stress. Nature Communications. 6, 10057 (2015).
- Zhai, R. G., et al. NAD synthase NMNAT acts as a chaperone to protect against neurodegeneration. Nature. 452 (7189), 887 (2008).
- Li, C., et al. Spermine synthase deficiency causes lysosomal dysfunction and oxidative stress in models of Snyder-Robinson syndrome. Nat Commun. 8 (1), 1257 (2017).
- Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. Development and structure of synaptic contacts in Drosophila. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).
- Maday, S., Holzbaur, E. L. Autophagosome biogenesis in primary neurons follows an ordered and spatially regulated pathway. Dev Cell. 30 (1), 71-85 (2014).
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Molecular biology of the cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
- Lee, S., Sato, Y., Nixon, R. A. Primary lysosomal dysfunction causes cargo-specific deficits of axonal transport leading to Alzheimer-like neuritic dystrophy. Autophagy. 7 (12), 1562-1563 (2011).
- Vincent, L., Soille, P. Watersheds in digital spaces: an efficient algorithm based on immersion simulations. IEEE Transactions on Pattern Analysis & Machine Intelligence. (6), 583-598 (1991).
- Najman, L., Schmitt, M. Geodesic saliency of watershed contours and hierarchical segmentation. IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence. 18 (12), 1163-1173 (1996).
- Shiber, A., Breuer, W., Ravid, T. Flow cytometric quantification and characterization of intracellular protein aggregates in yeast. Prion. 8 (3), 276-284 (2014).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).
