En optisk Assay for Synaptic vesikel genanvendelse i kulturperler neuroner overekspression præsynaptiske proteiner
Summary
Vi beskriver en optisk assay for synaptic vesikel (SV) genbrug i kulturperler neuroner. Kombinere denne protokol med dobbelt Transfektion udtrykke en præsynaptiske markør og protein af interesse tillader os at lokalisere præsynaptiske websteder, deres synaptic vesikel genanvendelse kapacitet, og bestemme rollen af protein af interesse.
Abstract
På aktive præsynaptiske nerve terminaler gennemgå synaptiske vesikler cyklusser af exo- og endocytose. Under genanvendelse, bliver de luminale domæner af SV transmembrane proteiner eksponeret på cellens overflade. En af disse proteiner er Synaptotagmin-1 (Syt1). Et antistof rettet mod den luminale domæne af Syt1, når de er tilføjet til næringssubstratet, er taget i løbet af exo-endocytotic cyklus. Denne optagelse er proportional med mængden af SV genbrug og kan kvantificeres ved immunfluorescens. Her, kombinerer vi Syt1 antistof optagelse med dobbelt Transfektion af kulturperler hippocampus neuroner. Dette giver os (1) lokalisere præsynaptiske websteder baseret på udtryk for rekombinante præsynaptiske markør Synaptophysin, (2) bestemme deres funktionalitet ved hjælp af Syt1 udbredelse og (3) karakteriserer målretning og virkningerne af en protein af interesse, normal god landbrugspraksis-Rogdi.
Introduction
Studerer synaptic vesikel genanvendelse er vigtigt ved fastsættelsen, hvordan præsynaptiske egenskaber ændre, enten under synaptisk plasticitet eller svar til undertrykkelse af netbårne synaptiske funktion. At studere Synaptotagmin-1 (Syt1) giver antistof optagelse én metode til måling af mængden af SV genanvendelse. Syt1 er en SV-forbundet protein, der fungerer som en Ca2 + -sensor og er nødvendige for at exocytotic udgivelsen af neurotransmitter1,2. Det er en transmembrane protein med en C-terminale cytoplasmatisk domæne uden SV og en N-terminale luminale domæne inde SV3. Under exocytose, bliver den luminale domæne af Syt1 udsat for den eksterne medium. Til denne eksterne medium tilføje vi antistoffer rettet mod den cytoplasmatisk domæne, som bliver internaliseret under endocytose. Disse antistoffer kan være enten pre konjugeret med fluorophores eller immunostained med sekundær antistoffer4,5,6,7. Fluorescens-intensiteten af den resulterende immunosignal er proportional med mængden af SV genanvendelse. Denne fremgangsmåde kan bruges til at bestemme både konstituerende og depolarisering-induceret SV genanvendelse6,8.
Syt1 optagelse assays kan udføres efter virus-medieret genoverførsel til stort set alle celler i skålen eller sparsomme Transfektion af et lille antal celler. Vores metode kombinerer analysen med sparsom dobbelt Transfektion af primære hippocampus neuroner ved hjælp af calciumphosphat9. Vi bruger en rekombinant markør protein kendt at akkumulere på presynapses, fluorescently mærket Synaptophysin, til at finde præsynaptiske terminaler og overexpress vores protein af interesse, Rogdi. Dette giver os mulighed for at teste eller ej Rogdi mål funktionelle synapser og påvirker SV genanvendelse. Det gen, der koder Rogdi blev oprindeligt identificeret i en skærm for Drosophila mutanter karakteriseret ved nedsat hukommelse10. Hos mennesker forårsage mutationer i Rogdi genet en sjælden og ødelæggende sygdom kaldet Kohlschütter-Tönz syndrom. Patienter lider af dental emalje misdannelser, pharmacoresistant epilepsi og psykomotoriske forsinkelser; dog forblev subcellulært lokaliseringen af produktets gen undvigende11. Således givet Syt1 optagelse assay afgørende bevis for lokalisering af normal god landbrugspraksis-mærket Rogdi på funktionelle synapser9.
Denne optagelse teknik har flere fordele. Først kan SV genanvendelse observeres både i realtid ved at udføre live imaging7,12, og efter fiksering6,9 ved at måle fluorescens-intensiteten af Syt1 fluorescens etiket. Derudover er flere Syt1 antistof varianter blevet udviklet. Der er ukodede varianter, der kan være mærket med en sekundær antistof efter en standard immunfarvning protokol efter fiksering og pre konjugeret varianter med et fluorescens etiket. Endelig er-antistof-baserede fluorescens fordelagtig på grund af det store udvalg af kommercielt tilgængelige sekundære eller konjugeret farvestoffer, der kan bruges.
Når fastsættelse og immunfarvning neuroner, det er også muligt at pletten for ekstra proteiner og udføre colocalization analyse. Dette kan hjælpe med at bestemme, hvor de er placeret i forhold til genanvendelse SVs. Intensiteten af fluorescens etiket er et direkte mål for mængden af SV genanvendelse. Derudover etiket antistoffer selektivt Syt1-holdige strukturer, hvilket resulterer i høj specificitet og lidt baggrund fluorescens4. Forskellige stimulation protokoller kan også bruges som depolarisering buffere eller elektrisk stimulation protokoller9,12,13,14. Basal SV genanvendelse kan dog måles uden stimulere neuronal kulturer15.
Vores metode omhandler specifikt Syt1 antistof optagelse i dobbelt-transfekteret neuroner med sekundær antistof immunolabeling efter fiksering. Men, vi henviser til alle rutinemæssigt anvendes varianter af analysen i vores diskussion at give seerne mulighed for at tilpasse protokollen til specifikke behov.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er tre assays rutinemæssigt anvendes til at studere synaptic vesikel (SV) genbrug. De første to omfatter anvendelse af en) fluorescerende styryl farvestoffer såsom FM1-43 (som indarbejde membraner, tages i organeller under endocytose og frigives efter exocytose); og b) fluorescently mærkede rekombinante SV proteiner (som ved overekspression, indarbejde de proteinholdige genanvendelse maskiner). Hvis de vedhæftede fluorophores ændrer deres fluorescens afhængigt af pH, kan de bruges til at overvåge ændringer m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Irmgard Weiss til teknisk ekspertbistand. Dette arbejde blev støttet af DFG via klyngen af ekspertise til mikroskopi på rækken nanometer og molekylær fysiologi af hjernen (CNMPB, B1-7, at T.D.).
Materials
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BSA | Sigma | A7030-50g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306-100g | |
| CoolSNAP HQ2 | Photometrics | ||
| dH2O | Invitrogen | 15230 | |
| DABCO | Merck | 8.03456.0100 | |
| donkey anti mouse Alexa 647 | Jackson-Immunoresearch | 715605151 | antibody |
| DMEM | Invitrogen | 41966 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| tube (50 mL) | Greiner Bio-One | 227261 | |
| FBS superior | BiochromAG | S0615 | |
| Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170 | |
| HEPES | Sigma | H4034-500g | |
| Hera Cell 150 (Inkubator) | ThermoElectron Corporation | ||
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541-500g | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030 | |
| MgCl2 | Honeywell | M0250-500g | |
| microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| OpenView Experiment Analysis Application | Free software, see comments | written by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Optimem | Invitrogen | 31985 | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| safety hood | ThermoElectron | Serial No. 40649111 | |
| Sucrose | neoFroxx | 1104kg001 | |
| Synaptotagmin1 | Synaptic Systems | 105311 | mouse monoclonal; clone 604.2 |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Water bath | GFL | 1004 | |
| Zeiss Observer. Z1 | Zeiss | ||
References
- Koh, T., Bellen, H. J. Synaptotagmin I, a Ca2+ sensor for neurotransmitter release. Trends in Neurosciences. 26, 413-422 (2003).
- Chapman, E. R. How Does Synaptotagmin Trigger Neurotransmitter Release. Annual Review of Biochemistry. 77, 615-641 (2008).
- Perin, M. S., et al. Structural and Functional Conservation of Synaptotagmin (p65) in Drosophila and Humans. Journal of Biological Chemistry. 266, 615-622 (1991).
- Matteoli, M., Takei, K., Perrin, M. S., Südhof, T. C., De Camilli, P. Exo-endocytotic Recycling of Synaptic Vesicles in Developing Processes of Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Cell Biology. 117, 849-861 (1992).
- Ko, J., et al. Neuroligin-1 performs neurexin-dependent and neurexin-independent functions in synapse validation. The EMBO Journal. 28, 3244-3255 (2009).
- Shinoda, Y., et al. BDNF enhances spontaneous and activity-dependent neurotransmitter release at excitatory terminals but not at inhibitory terminals in hippocampal neurons. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 27 (2014).
- Ivanova, D., et al. Synaptic activity controls localization and function of CtBP 1 via binding to Bassoon and Piccolo. The EMBO Journal. 34, 1056-1077 (2015).
- Crawford, D. C., Ramirez, D. M. O., Trauterman, B., Monteggia, L. M., Kavalali, E. T. Selective molecular impairment of spontaneous neurotransmission modulates synaptic efficacy. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
- Riemann, D., Wallrafen, R., Dresbach, T. The Kohlschütter-Tönz syndrome associated gene Rogdi encodes a novel presynaptic protein. Scientific Reports. 7, (2017).
- Kim, M., et al. Rogdi Defines GABAergic Control of a Wake-promoting Dopaminergic Pathway to Sustain Sleep in Drosophila. Scientific Reports. 7, 1-14 (2017).
- Schossig, A., Wolf, N. I., Kapferer, I., Kohlschütter, A., Zschocke, J. Epileptic encephalopathy and amelogenesis imperfecta: Kohlschütter-Tönz syndrome. Euopean Journal of Medical Genetics. 55, 319-322 (2012).
- Kraszewski, K., et al. Synaptic Vesicle Dynamics in Living Cultured Hippocampal Neurons Visualized with CY3-Conjugated Antibodies Directed against the Lumenal Domain of Synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15, 4328-4342 (1995).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
- Petkova, A., Goedecke, N., Korte, M., Dresbach, T. Neuroligins mediate presynaptic maturation through brain-derived neurotrophic factor signaling. bioRxiv. , 262246 (2018).
- Fuchs, C., et al. GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses. European Journal of Neuroscience. 38, 3146-3158 (2013).
- Dresbach, T., et al. Functional regions of the presynaptic cytomatrix protein Bassoon: Significance for synaptic targeting and cytomatrix anchoring. Molecular and Cellular Neuroscience. 23, 279-291 (2003).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice. Journal of Visualized Experiments. (65), 4-9 (2012).
- Tsuriel, S., et al. Local sharing as a predominant determinant of synaptic matrix molecular dynamics. PLOS Biology. 4, 1572-1587 (2006).
- Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. Journal of Visualized Experiments. (85), 1-10 (2014).
- Villarreal, S., Lee, S. H., Wu, L. Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), 1-8 (2017).
- Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nature Neuroscience. 17, 10-16 (2014).
- Opazo, F., et al. Limited Intermixing of Synaptic Vesicle Components upon Vesicle Recycling. Traffic. 11, 800-812 (2010).
- Wollebo, H. S., Woldemichaele, B., White, M. K. Lentiviral transduction of neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1078, 141-146 (2013).
- Yang, X., Kaeser-Woo, Y. J., Pang, Z. P., Xu, W., Südhof, T. C. Complexin Clamps Asynchronous Release by Blocking a Secondary Ca2+ Sensor via Its Accessory α Helix. Neuron. 68, 907-920 (2010).
- Wittenmayer, N., et al. Postsynaptic Neuroligin1 regulates presynaptic maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13564-13569 (2009).
- Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive Remodeling of the Presynaptic Cytomatrix upon Homeostatic Adaptation to Network Activity Silencing. Journal of Neuroscience. 31, 10189-10200 (2011).
- Kraszewski, K., Daniell, L., Mundigl, O., De Camilli, P. Mobility of synaptic vesicles in nerve endings monitored by recovery from photobleaching of synaptic vesicle-associated fluorescence. Journal of Neuroscience. 16, 5905-5913 (1996).
- Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nature Neuroscience. 13, 1451-1453 (2010).
- Han, W., et al. N-Glycosylation Is Essential for Vesicular Targeting of Synaptotagmin 1. Neuron. 41, 85-99 (2004).
- Kwon, S. E., Chapman, E. R. Glycosylation is dispensable for sorting of synaptotagmin 1 but is critical for targeting of SV2 and synaptophysin to recycling synaptic vesicles. Journal of Biological Chemistry. 287, 35658-35668 (2012).
- Afuwape, O. A. T., Wasser, C. R., Schikorski, T., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle pool-specific modification of neurotransmitter release by intravesicular free radical generation. The Journal of Physiology. 595, 1223-1238 (2017).
- Sara, Y., Virmani, T., Deák, F., Liu, X., Kavalali, E. T. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
- Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nature Neuroscience. 13, 1454-1456 (2010).
- Bacci, A., et al. Chronic blockade of glutamate receptors enhances presynaptic release and downregulates the interaction between synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated membrane protein 2. Journal of Neuroscience. 21, 6588-6596 (2001).
- Piccoli, G., et al. LRRK2 Controls Synaptic Vesicle Storage and Mobilization within the Recycling Pool. Journal of Neuroscience. 31, 2225-2237 (2011).
- Tracy, T. E., Yan, J. J., Chen, L. Acute knockdown of AMPA receptors reveals a trans-synaptic signal for presynaptic maturation. The EMBO Journal. 30, 1577-1592 (2011).
- Truckenbrdot, S., Viplav, A., Jaehne, S., Vogts, A., Denker, A., Wildhagen, H., Fornasiero, E. F., Rizzoli, S. O. Ageing synaptic vesicles are inactivated by contamination with SNAP25. bioRxiv. , 172239 (2017).
