Un test ottico per riciclo delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni che Overexpressing proteine presinaptiche
Summary
Descriviamo un test ottico per vescicole sinaptiche (SV) riciclaggio in colture di neuroni. Combinando questo protocollo con doppia transfezione di esprimere un marcatore presinaptica e la proteina di interesse ci permette di individuare siti presinaptici, loro delle vescicole sinaptiche capacità di riciclaggio e di determinare il ruolo della proteina di interesse.
Abstract
Alle terminazioni nervose presinaptiche attivo, vescicole sinaptiche sono sottoposti a cicli di exo – ed endocitosi. Durante il riciclaggio, i luminal domini delle proteine transmembrana SV diventano esposti alla superficie delle cellule. Una di queste proteine è Synaptotagmin-1 (Syt1). Un anticorpo diretto contro il dominio luminale di Syt1, una volta aggiunto al terreno di coltura, è ripreso durante il ciclo eso-endocitotico. Questo assorbimento è proporzionale alla quantità di SV riciclaggio e possa essere quantificato mediante immunofluorescenza. Qui, uniamo l’assorbimento di anticorpo Syt1 con doppia transfezione delle colture di neuroni ippocampali. Questo ci permette di (1) localizzare siti presinaptici basati sull’espressione del marcatore presinaptica ricombinante Synaptophysin, (2) determinare la loro funzionalità mediante l’assorbimento Syt1 e (3) caratterizzare il targeting e gli effetti di una proteina di interesse, GFP-Rogdi.
Introduction
Lo studio di riciclo delle vescicole sinaptiche è importante nel determinare come modificare proprietà presinaptici, durante plasticità sinaptica o in risposta alla perturbazione della funzione sinaptica. L’assorbimento dell’anticorpo studiando Synaptotagmin-1 (Syt1) fornisce il metodo di misurazione della quantità di riciclaggio SV. Syt1 è una SV-collegata della proteina che agisce come un sensore di Ca2 + ed è necessario per il rilascio esocitotico di neurotrasmettitore1,2. È una proteina transmembrana con un dominio citoplasmico del C-terminale fuori la SV e un dominio luminale del N-terminale all’interno delle SV3. Durante l’esocitosi, il dominio luminale di Syt1 diventa esposte al mezzo esterno. A questo mezzo esterno, aggiungiamo gli anticorpi diretti contro il dominio citoplasmatico, che diventa interiorizzato durante endocitosi. Questi anticorpi possono essere che sia pre-coniugato con fluorofori o immunostained con anticorpi secondari4,5,6,7. L’intensità di fluorescenza del immunosignal risultante è proporzionale alla quantità di riciclaggio SV. Questo approccio può essere utilizzato per determinare sia costitutiva e indotto da depolarizzazione SV riciclaggio6,8.
Saggi di Syt1 l’assorbimento possono essere eseguite dopo virus-mediata del gene transfer a virtualmente tutte le cellule nel piatto o dopo trasfezione sparse di un piccolo numero di cellule. Il nostro metodo combina il dosaggio con doppia sparsa transfezione dei neuroni hippocampal primari con fosfato di calcio9. Usiamo una proteina ricombinante marcatore conosciuta ad accumularsi in presynapses, lo Synaptophysin fluorescente contrassegnato, per individuare i terminali presinaptici e overexpress nostra proteina d’interesse, Rogdi. Questo ci permette di testare o meno Rogdi obiettivi funzionali sinapsi e colpisce SV riciclaggio. Il gene che codifica per Rogdi originalmente è stato identificato in una schermata per mutanti Drosophila caratterizzate da indebolimento della memoria10. Nell’uomo, le mutazioni nel gene Rogdi provocare una rara e devastante malattia chiamata sindrome di Kohlschütter-Tönz. I pazienti soffrono di malformazioni dello smalto dentale, Sturm epilessia e ritardo psicomotorio; Tuttavia, la localizzazione subcellulare del prodotto del gene è rimasto inafferrabile11. Così, l’analisi di assorbimento Syt1 fornito la prova chiave per la localizzazione di GFP-etichettato Rogdi alle sinapsi funzionali9.
Questa tecnica di assorbimento ha diversi vantaggi. In primo luogo, SV riciclaggio possa essere osservato sia in tempo reale eseguendo dal vivo imaging7,12e dopo fissazione6,9 misurando l’intensità della fluorescenza dell’etichetta Syt1 fluorescenza. Inoltre, sono state sviluppate diverse varianti di anticorpo Syt1. Esistono varianti senza tag che possono essere etichettati con un anticorpo secondario seguendo un protocollo standard immunostaining dopo la fissazione e varianti pre-coniugati con un’etichetta di fluorescenza già fissata. Infine, anticorpo-basato fluorescenza è vantaggioso dovuto la vasta selezione di coloranti secondari o coniugati commercialmente disponibile che può essere utilizzato.
Quando fissaggio e immunostaining i neuroni, è anche possibile macchiare per altre proteine ed eseguire analisi di colocalizzazione. Questo può aiutare a determinare dove si trovano in relazione riciclaggio SVs. L’intensità dell’etichetta fluorescenza è la misura diretta della quantità di SV riciclaggio. Inoltre, gli anticorpi etichetta selettivamente strutture contenenti Syt1, con conseguente elevata specificità e piccolo sfondo fluorescenza4. Protocolli di stimolazione differenti possono essere utilizzati, ad esempio buffer di depolarizzazione o stimolazione elettrica protocolli9,12,13,14. Tuttavia, riciclaggio di SV basale può essere misurata senza stimolare le colture neuronali15.
Il nostro metodo affronta specificamente l’assorbimento dell’anticorpo Syt1 nei neuroni double-trasfettate con anticorpo secondario immunolabeling dopo la fissazione. Tuttavia, ci riferiamo a tutte le varianti ordinariamente usate del dosaggio nella nostra discussione di dare agli spettatori l’opportunità di adattare il protocollo alle esigenze specifiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono tre saggi abitualmente utilizzati per lo studio delle vescicole sinaptiche (SV) riciclaggio. I primi due includono l’uso di un) styryl fluorescente tinture ad esempio FM1-43 (che incorporano nelle membrane, sono presi in organelli durante endocitosi e vengono rilasciati dopo l’esocitosi); e b) etichetta fluorescente proteine ricombinanti SV (che, al momento sovraespressione, incorporano i macchinari riciclaggio proteinico). Se i fluorophores allegata cambiare loro fluorescenza a seconda del pH, essi utilizzabile …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Irmgard Weiss per assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato dal DFG tramite il Cluster di eccellenza per la microscopia a campo del nanometro e fisiologia molecolare del cervello (CNMPB, B1-7, a T.D.).
Materials
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BSA | Sigma | A7030-50g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306-100g | |
| CoolSNAP HQ2 | Photometrics | ||
| dH2O | Invitrogen | 15230 | |
| DABCO | Merck | 8.03456.0100 | |
| donkey anti mouse Alexa 647 | Jackson-Immunoresearch | 715605151 | antibody |
| DMEM | Invitrogen | 41966 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| tube (50 mL) | Greiner Bio-One | 227261 | |
| FBS superior | BiochromAG | S0615 | |
| Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170 | |
| HEPES | Sigma | H4034-500g | |
| Hera Cell 150 (Inkubator) | ThermoElectron Corporation | ||
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541-500g | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030 | |
| MgCl2 | Honeywell | M0250-500g | |
| microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| OpenView Experiment Analysis Application | Free software, see comments | written by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Optimem | Invitrogen | 31985 | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| safety hood | ThermoElectron | Serial No. 40649111 | |
| Sucrose | neoFroxx | 1104kg001 | |
| Synaptotagmin1 | Synaptic Systems | 105311 | mouse monoclonal; clone 604.2 |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Water bath | GFL | 1004 | |
| Zeiss Observer. Z1 | Zeiss | ||
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