シナプス小胞の培養神経細胞シナプス蛋白質の過剰発現でリサイクルのため光アッセイ
Summary
シナプス小胞 (SV) 培養神経細胞におけるリサイクルの光分析について述べる。このプロトコルを組み合わせて二重トランスフェクション シナプス マーカーおよび興味の蛋白質を表現する容量をリサイクル、シナプス小胞のシナプス前のサイトを見つけて、興味の蛋白質の役割を決定することができます。
Abstract
アクティブのシナプス前神経終末では、シナプス小胞は exo とエンドサイトーシスのサイクルを受けます。リサイクル中に SV 膜貫通タンパク質の内腔のドメインは細胞表面でさらされます。これらの蛋白質の 1 つは、シナプトタグミン 1 (Syt1) です。培養液に追加した Syt1 の内腔のドメインに対する抗体は、エキソ エンドサイトーシス サイクル中にとられます。この吸収は SV が再資源化量に比例して蛍光抗体法で定量化することができます。ここでは、培養海馬神経細胞の二重トランスフェクション Syt1 抗体吸収と組み合わせています。これにより (1) 遺伝子組換えシナプス マーカー シナプトフィジン発現に基づくシナプス前サイトのローカライズ (2) Syt1 吸収を使用して機能を判断し、(3) 対象を特徴付けることと興味、GFP Rogdi の蛋白質の効果。
Introduction
シナプス小胞のリサイクルを勉強は、シナプス前のプロパティが変更されたシナプス可塑性中またはシナプス機能の摂動応答の方法を決定するのに重要です。抗体吸収シナプトタグミン 1 (Syt1) を勉強して SV リサイクルの量を測定する方法の 1 つを提供します。Syt1 は Ca2 +センサーとして機能し、神経伝達物質1,2の分泌のリリースに必要な SV 関連タンパク質です。SV 外 C 末端の細胞質ドメインと SV3中 N ターミナル内腔ドメイン膜貫通蛋白質であります。エキソサイトーシス、時 Syt1 の内腔のドメインは外部メディアに露出になります。この外部の媒体には、エンドサイトーシス中に内面になる細胞質ドメインに対する抗体を追加します。これらの抗体は、どちらかはあらかじめ fluorophores が付いてまたは二次抗体4,5,6,7immunostained 共役することができます。結果 immunosignal の蛍光強度は SV リサイクルの量に比例します。このアプローチは、6、8をリサイクル構成と脱分極誘導の SV を決定する使用できます。
Syt1 取り込みアッセイは、料理のほぼすべてのセルにウイルス媒介性遺伝子導入後、または少数の細胞の疎なトランスフェクション後に実行できます。本手法は、リン酸カルシウムの9を使用してプライマリの海馬ニューロンのスパース ダブル トランスフェクションとアッセイを兼ね備えています。我々 は神経終末を検索し、Rogdi の興味の私達の蛋白質をノザン蛍光タグ シナプトフィジン、presynapses で蓄積する知られていた遺伝子組換えマーカー蛋白質を使用します。Rogdi ターゲット機能がシナプスし、リサイクル SV に影響を与えるかどうかをテストことができます。Rogdi 遺伝子はもともと障害メモリ10によって特徴付けられるショウジョウバエ変異体の画面で同定されました。人間では、Rogdi 遺伝子の変異は、Kohlschütter Tönz 症候群と呼ばれる稀で、壊滅的な病気を引き起こします。患者は苦しむエナメル奇形、pharmacoresistant てんかん、精神運動遅延;しかし、遺伝子産物の細胞内局在は、とらえどころのない11を残った。したがって、Syt1 取り込みアッセイは、機能的なシナプス9時 GFP 付けられた Rogdi の局在化のため重要な証拠を提供しました。
この摂取方法には、いくつかの利点があります。まず、SV リサイクル観察できます両方リアルタイムでライブ イメージング7,12, を実行し、後に固定6,9 Syt1 蛍光ラベルの蛍光強度を測定することによって。さらに、いくつかの Syt1 抗体バリエーションが開発されています。固定後の免疫染色標準プロトコルの二次抗体を標識できますタグなしの変形そして既にアタッチされている蛍光ラベルを持つ共役事前の変形があります。最後に、抗体を用いた蛍光は使用できる市販のセカンダリまたは共役染料の大規模な選択のため有利です。
とき固定と染色ニューロンそれはまた追加タンパク質の染色し、共局在解析を実行することが可能。これはリサイクルの SVs に関連して保存されている場所を決定することができます。蛍光ラベルの強度は SV リサイクル量の直接測定です。さらに、抗体は選択的に Syt1 含む構造、高い特異性と小さなバック グラウンド蛍光4の結果をラベルします。脱分極のバッファーや電気刺激プロトコル9,12,13,14など、異なる刺激のプロトコルも使用できます。ただし、基底の SV のリサイクルは神経文化15を刺激することがなく測定できます。
本手法は特に固定後二次抗体反応二重 transfected ニューロン Syt1 抗体吸収を対処します。しかし、我々 はプロトコル固有のニーズに適応する機会を視聴者に我々 の議論のアッセイのすべての日常的に使用された変形を参照します。
Protocol
Representative Results
Discussion
日常的にシナプス小胞 (SV) リサイクルを研究するために使用 3 つの試金があります。最初の 2 つの使用を含む、) 蛍光スチリル色素など FM1-43 (これは膜に組み込む、エンドサイトーシス、中に細胞小器官にとられ、開口放出後にリリースされる);b) 蛍光付けられた (これは、過剰発現時にタンパク質のリサイクル機械を組み込む) 遺伝子組換えの SV 蛋白質。添付の fluorophores が付いて、pH によ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
サポート ヴァイスシュヴァルツは、専門的な技術支援を感謝いたします。この作業は、顕微鏡、ナノメートルの範囲のための卓越性のクラスターと (CNMPB, B1-7、両手を使ったのため) 脳の分子生理学を介して DFG によって支えられました。
Materials
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BSA | Sigma | A7030-50g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306-100g | |
| CoolSNAP HQ2 | Photometrics | ||
| dH2O | Invitrogen | 15230 | |
| DABCO | Merck | 8.03456.0100 | |
| donkey anti mouse Alexa 647 | Jackson-Immunoresearch | 715605151 | antibody |
| DMEM | Invitrogen | 41966 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| tube (50 mL) | Greiner Bio-One | 227261 | |
| FBS superior | BiochromAG | S0615 | |
| Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170 | |
| HEPES | Sigma | H4034-500g | |
| Hera Cell 150 (Inkubator) | ThermoElectron Corporation | ||
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541-500g | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030 | |
| MgCl2 | Honeywell | M0250-500g | |
| microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| OpenView Experiment Analysis Application | Free software, see comments | written by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Optimem | Invitrogen | 31985 | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| safety hood | ThermoElectron | Serial No. 40649111 | |
| Sucrose | neoFroxx | 1104kg001 | |
| Synaptotagmin1 | Synaptic Systems | 105311 | mouse monoclonal; clone 604.2 |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Water bath | GFL | 1004 | |
| Zeiss Observer. Z1 | Zeiss | ||
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