Optisk analysen for Synaptic Vesicle resirkulering i kulturperler Neurons Overexpressing Presynaptic proteiner
Summary
Vi beskriver en optisk analysen for synaptic vesicle (SV) resirkulering i kulturperler neurons. Kombinere denne protokollen med dobbel transfection å uttrykke en presynaptic markør og protein rundt tillater oss å finne presynaptic steder, deres synaptic vesicle resirkulering kapasitet, og bestemme rollen protein av interesse.
Abstract
På aktive presynaptic nerve terminaler gjennom synaptic blemmer sykluser av exo- og endocytose. Under resirkulering, bli luminal domener av SV transmembrane proteiner eksponert på celleoverflaten. En av disse proteinene er Synaptotagmin-1 (Syt1). Et antistoff rettet mot luminal domenet Syt1, når lagt til kultur medium, blir tatt opp under exo-endocytotic syklus. Denne opptak er proporsjonal med mengden SV resirkulering og kan kvantifiseres gjennom immunofluorescence. Her kombineres Syt1 antistoff opptak med dobbel transfection kulturperler hippocampus neurons. Dette tillater oss å (1) lokalisere presynaptic nettsteder basert på uttrykk av rekombinant presynaptic merket Synaptophysin, (2) finne funksjonaliteten benytter Syt1 opptak og (3) karakterisere målretting og effekter av et protein av interesse, GFP-Rogdi.
Introduction
Studere synaptic vesicle resirkulering er viktig for å bestemme hvordan presynaptic egenskaper endre, under synaptiske plastisitet eller svar på forstyrrelsene av synaptiske funksjon. Antistoff opptak studere Synaptotagmin-1 (Syt1) og gir en metode for å måle hvor mye SV resirkulering. Syt1 er et SV-assosiert protein som fungerer som en Ca2 + sensor og er nødvendig for exocytotic utgivelsen av nevrotransmitter1,2. Det er en transmembrane protein med en C-terminalen cytoplasmatiske domenet utenfor SV og et N-terminal luminal domene innenfor SV3. Under exocytosis, blir luminal domenet Syt1 utsatt for eksterne medium. Til eksterne mediet, legger vi til antistoffer rettet mot cytoplasmatiske domenet, som blir internalisert under endocytose. Disse antistoffene kan være enten pre konjugert med fluorophores eller immunostained med sekundær antistoffer4,5,6,7. Fluorescens intensiteten av den resulterende immunosignal er proporsjonal med mengden SV resirkulering. Denne fremgangsmåten kan brukes til å fastsette både grunnleggende og depolarization-indusert SV resirkulering6,8.
Syt1 opptak analyser kan utføres etter virus-mediert genoverføring til nesten alle celler i retten eller sparsom transfection av et lite antall celler. Vår metode kombinerer analysen med sparsom dobbelt hva primære hippocampus neurons bruker kalsium fosfat9. Vi bruker et rekombinant markør protein kalt å samle på presynapses, fluorescently merket Synaptophysin, å finne presynaptic terminaler og overexpress våre protein av interesse, Rogdi. Dette tillater oss å teste om Rogdi mål funksjonelle synapser og påvirker SV resirkulering. Genet koding Rogdi var opprinnelig identifisert i skjermen for Drosophila mutanter preget av nedsatt minne10. Hos mennesker føre mutasjoner i genet Rogdi en sjelden og ødeleggende sykdom som kalles Kohlschütter-Tönz syndrom. Pasienter lider dental emaljen misdannelser, pharmacoresistant epilepsi og psykomotorisk forsinkelser; men vært den subcellular lokaliseringen av gene produktet unnvikende11. Dermed gitt Syt1 opptaksanalyse viktige bevis lokalisering av GFP-merket Rogdi funksjonelle synapser9.
Denne opptak teknikken har flere fordeler. Først kan SV gjenvinning observeres både i sanntid ved å utføre live bildebehandling7,12, og etter fiksering6,9 ved å måle fluorescens intensiteten av Syt1 fluorescens etiketten. I tillegg har flere Syt1 antistoff varianter blitt utviklet. Det er ukodede varianter som kan merkes med en sekundær antistoff etter en standard immunostai-protokoll etter fiksering og pre konjugert varianter med en fluorescens etikett allerede vedlagt. Endelig er antistoff-baserte fluorescens fordelaktig på grunn av det store utvalget av tilgjengelige sekundær eller konjugert fargestoffer som kan brukes.
Når fikse og immunostai-neurons, det er også mulig å flekk for ekstra proteiner og utføre colocalization analyse. Dette kan hjelpe bestemme hvor de befinner seg i forhold til resirkulering SVs. Intensiteten av fluorescens måles direkte i mengden av SV resirkulering. I tillegg etiketten antistoffer selektivt Syt1 inneholder strukturer, som resulterer i høy spesifisitet og liten bakgrunn fluorescens4. Forskjellige stimulering protokoller kan også brukes som depolarization buffere eller elektrisk stimulering, protokoller,9,,12,,13,,14. Men kan basale SV gjenvinning måles uten å stimulere neuronal kulturer15.
Vår metode omhandler spesifikt Syt1 antistoff opptak i double-transfekterte neurons med sekundær antistoff immunolabeling etter fiksering. Men referere vi til alle rutinemessig brukes varianter av analysen i vår diskusjon å gi seerne muligheten til å tilpasse protokollen behov.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er tre analyser rutinemessig brukes til studere synaptic vesicle (SV) resirkulering. To første omfatter bruk av en) fluorescerende styryl fargestoffer som FM1-43 (som innlemme i membraner er tatt opp til organeller under endocytose og er utgitt etter exocytosis); og b) fluorescently merket rekombinant SV proteiner (som, på overuttrykte, innlemme i proteinaceous gjenvinning maskiner). Hvis de vedlagte fluorophores endrer deres fluorescens avhengig av pH, kan de brukes til å overvåke endringer mellom syreholdig int…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Irmgard Weiss for ekspert teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av DFG via klyngen kompetansesenter for mikroskopi på nanometer området og molekylære fysiologi av hjernen (CNMPB, B1-7 til T.D.).
Materials
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BSA | Sigma | A7030-50g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306-100g | |
| CoolSNAP HQ2 | Photometrics | ||
| dH2O | Invitrogen | 15230 | |
| DABCO | Merck | 8.03456.0100 | |
| donkey anti mouse Alexa 647 | Jackson-Immunoresearch | 715605151 | antibody |
| DMEM | Invitrogen | 41966 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| tube (50 mL) | Greiner Bio-One | 227261 | |
| FBS superior | BiochromAG | S0615 | |
| Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170 | |
| HEPES | Sigma | H4034-500g | |
| Hera Cell 150 (Inkubator) | ThermoElectron Corporation | ||
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541-500g | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030 | |
| MgCl2 | Honeywell | M0250-500g | |
| microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| OpenView Experiment Analysis Application | Free software, see comments | written by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Optimem | Invitrogen | 31985 | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| safety hood | ThermoElectron | Serial No. 40649111 | |
| Sucrose | neoFroxx | 1104kg001 | |
| Synaptotagmin1 | Synaptic Systems | 105311 | mouse monoclonal; clone 604.2 |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Water bath | GFL | 1004 | |
| Zeiss Observer. Z1 | Zeiss | ||
References
- Koh, T., Bellen, H. J. Synaptotagmin I, a Ca2+ sensor for neurotransmitter release. Trends in Neurosciences. 26, 413-422 (2003).
- Chapman, E. R. How Does Synaptotagmin Trigger Neurotransmitter Release. Annual Review of Biochemistry. 77, 615-641 (2008).
- Perin, M. S., et al. Structural and Functional Conservation of Synaptotagmin (p65) in Drosophila and Humans. Journal of Biological Chemistry. 266, 615-622 (1991).
- Matteoli, M., Takei, K., Perrin, M. S., Südhof, T. C., De Camilli, P. Exo-endocytotic Recycling of Synaptic Vesicles in Developing Processes of Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Cell Biology. 117, 849-861 (1992).
- Ko, J., et al. Neuroligin-1 performs neurexin-dependent and neurexin-independent functions in synapse validation. The EMBO Journal. 28, 3244-3255 (2009).
- Shinoda, Y., et al. BDNF enhances spontaneous and activity-dependent neurotransmitter release at excitatory terminals but not at inhibitory terminals in hippocampal neurons. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 27 (2014).
- Ivanova, D., et al. Synaptic activity controls localization and function of CtBP 1 via binding to Bassoon and Piccolo. The EMBO Journal. 34, 1056-1077 (2015).
- Crawford, D. C., Ramirez, D. M. O., Trauterman, B., Monteggia, L. M., Kavalali, E. T. Selective molecular impairment of spontaneous neurotransmission modulates synaptic efficacy. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
- Riemann, D., Wallrafen, R., Dresbach, T. The Kohlschütter-Tönz syndrome associated gene Rogdi encodes a novel presynaptic protein. Scientific Reports. 7, (2017).
- Kim, M., et al. Rogdi Defines GABAergic Control of a Wake-promoting Dopaminergic Pathway to Sustain Sleep in Drosophila. Scientific Reports. 7, 1-14 (2017).
- Schossig, A., Wolf, N. I., Kapferer, I., Kohlschütter, A., Zschocke, J. Epileptic encephalopathy and amelogenesis imperfecta: Kohlschütter-Tönz syndrome. Euopean Journal of Medical Genetics. 55, 319-322 (2012).
- Kraszewski, K., et al. Synaptic Vesicle Dynamics in Living Cultured Hippocampal Neurons Visualized with CY3-Conjugated Antibodies Directed against the Lumenal Domain of Synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15, 4328-4342 (1995).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
- Petkova, A., Goedecke, N., Korte, M., Dresbach, T. Neuroligins mediate presynaptic maturation through brain-derived neurotrophic factor signaling. bioRxiv. , 262246 (2018).
- Fuchs, C., et al. GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses. European Journal of Neuroscience. 38, 3146-3158 (2013).
- Dresbach, T., et al. Functional regions of the presynaptic cytomatrix protein Bassoon: Significance for synaptic targeting and cytomatrix anchoring. Molecular and Cellular Neuroscience. 23, 279-291 (2003).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice. Journal of Visualized Experiments. (65), 4-9 (2012).
- Tsuriel, S., et al. Local sharing as a predominant determinant of synaptic matrix molecular dynamics. PLOS Biology. 4, 1572-1587 (2006).
- Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. Journal of Visualized Experiments. (85), 1-10 (2014).
- Villarreal, S., Lee, S. H., Wu, L. Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), 1-8 (2017).
- Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nature Neuroscience. 17, 10-16 (2014).
- Opazo, F., et al. Limited Intermixing of Synaptic Vesicle Components upon Vesicle Recycling. Traffic. 11, 800-812 (2010).
- Wollebo, H. S., Woldemichaele, B., White, M. K. Lentiviral transduction of neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1078, 141-146 (2013).
- Yang, X., Kaeser-Woo, Y. J., Pang, Z. P., Xu, W., Südhof, T. C. Complexin Clamps Asynchronous Release by Blocking a Secondary Ca2+ Sensor via Its Accessory α Helix. Neuron. 68, 907-920 (2010).
- Wittenmayer, N., et al. Postsynaptic Neuroligin1 regulates presynaptic maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13564-13569 (2009).
- Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive Remodeling of the Presynaptic Cytomatrix upon Homeostatic Adaptation to Network Activity Silencing. Journal of Neuroscience. 31, 10189-10200 (2011).
- Kraszewski, K., Daniell, L., Mundigl, O., De Camilli, P. Mobility of synaptic vesicles in nerve endings monitored by recovery from photobleaching of synaptic vesicle-associated fluorescence. Journal of Neuroscience. 16, 5905-5913 (1996).
- Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nature Neuroscience. 13, 1451-1453 (2010).
- Han, W., et al. N-Glycosylation Is Essential for Vesicular Targeting of Synaptotagmin 1. Neuron. 41, 85-99 (2004).
- Kwon, S. E., Chapman, E. R. Glycosylation is dispensable for sorting of synaptotagmin 1 but is critical for targeting of SV2 and synaptophysin to recycling synaptic vesicles. Journal of Biological Chemistry. 287, 35658-35668 (2012).
- Afuwape, O. A. T., Wasser, C. R., Schikorski, T., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle pool-specific modification of neurotransmitter release by intravesicular free radical generation. The Journal of Physiology. 595, 1223-1238 (2017).
- Sara, Y., Virmani, T., Deák, F., Liu, X., Kavalali, E. T. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
- Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nature Neuroscience. 13, 1454-1456 (2010).
- Bacci, A., et al. Chronic blockade of glutamate receptors enhances presynaptic release and downregulates the interaction between synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated membrane protein 2. Journal of Neuroscience. 21, 6588-6596 (2001).
- Piccoli, G., et al. LRRK2 Controls Synaptic Vesicle Storage and Mobilization within the Recycling Pool. Journal of Neuroscience. 31, 2225-2237 (2011).
- Tracy, T. E., Yan, J. J., Chen, L. Acute knockdown of AMPA receptors reveals a trans-synaptic signal for presynaptic maturation. The EMBO Journal. 30, 1577-1592 (2011).
- Truckenbrdot, S., Viplav, A., Jaehne, S., Vogts, A., Denker, A., Wildhagen, H., Fornasiero, E. F., Rizzoli, S. O. Ageing synaptic vesicles are inactivated by contamination with SNAP25. bioRxiv. , 172239 (2017).
