Оптических Assay для синаптических пузырьков рециркуляции в культивированный нейронов, экспрессирующих Пресинаптический белки
Summary
Мы описываем оптических assay для синаптических пузырьков (SV) рециркуляции в культивированный нейронов. Сочетание этот протокол с двойной трансфекции выразить Пресинаптический маркер и протеин интереса позволяет нам найти Пресинаптический сайтов, их синаптических пузырьков, утилизации потенциала и определить роль протеина интереса.
Abstract
В активных Пресинаптический нервных окончаний синаптических пузырьков проходить циклы экзо – и эндоцитоз. В процессе рециркуляции, просветный домены SV трансмембранные белки подвергаются на поверхности клеток. Один из этих белков-Синаптотагмин-1 (Syt1). Антитела, направленные против Люминал домен Syt1, однажды добавила к питательной среды, take up в ходе экзо endocytotic цикла. Это поглощение пропорционально количеству SV рециркуляции и может быть определена количественно через иммунофлюоресценции. Здесь мы сочетаем Syt1 антитела поглощения с двойной трансфекции культивировали гиппокампа нейронов. Это позволяет нам (1) локализации Пресинаптический сайты, основанные на выражения рекомбинантных Пресинаптический маркера Synaptophysin, (2) определить их функциональность с помощью Syt1 поглощения и (3) характеризуют ориентации и эффекты белка интерес, GFP-Rogdi.
Introduction
Изучая синаптических пузырьков рециркуляции важную роль в определении как Пресинаптический свойств изменить, либо во время синаптической пластичности, или в ответ на возмущение синаптических функции. Изучение Синаптотагмин-1 (Syt1) антитела поглощение предоставляет один метод измерения объема переработки SV. Syt1 — SV-связанный белок, который действует как Ca2 + датчик и необходимые для exocytotic выпуска нейромедиатора1,2. Это трансмембранный белок с C-терминал цитоплазматических доменов вне SV и N-терминальный Люминал домена внутри SV-3. Во время экзоцитоз становится подвергаются Люминал домена Syt1 на внешний носитель. Этот внешний носитель мы добавляем антитела, направленные против цитоплазмы домен, который становится внутренним во время эндоцитоз. Эти антитела могут быть либо предварительно проспряганное с флуорофоров или immunostained с вторичные антитела4,5,6,7. Интенсивность флуоресценции результате immunosignal пропорциональна количество SV рециркуляции. Этот подход может использоваться для определения составных и деполяризации индуцированной SV рециркуляции6,8.
Syt1 поглощение анализов может выполняться после генов вируса опосредованной передачи практически все клетки в блюдо или разреженный трансфекции небольшого числа клеток. Наш метод сочетает в себе проба разреженных двойной трансфекции первичного гиппокампа нейронов, при использовании фосфата кальция9. Мы используем рекомбинантных маркер протеин, называемый накапливаться в presynapses, дневно тегами Synaptophysin, чтобы найти Пресинаптический терминалы и overexpress наш протеин интереса, Rogdi. Это позволяет нам проверить ли или не Rogdi цели функциональных синапсов и влияет на SV рециркуляции. Гену Rogdi был первоначально определен на экране дрозофилы мутантов, характеризующееся нарушением памяти10. В организме человека мутации в гене Rogdi вызывают редких и разрушительные болезнь под названием Kohlschütter-Tönz синдром. Пациенты страдают от пороков развития зубной эмали, фармакорезистентности эпилепсии и психомоторные задержки; Однако субцеллюлярные локализации продукта гена оставался неуловимым11. Таким образом пробирного поглощение Syt1 представил основные доказательства для локализации GFP-тегами Rogdi функциональных синапсы9.
Эта техника поглощение имеет несколько преимуществ. Во-первых SV рециркуляции может наблюдаться как в режиме реального времени, выполняя живых изображений7,12и после фиксации6,9 путем измерения интенсивности флуоресценции Syt1 флуоресцентной метки. Кроме того были разработаны несколько вариантов Syt1 антитела. Есть непомеченным варианты, которые могут быть помечены вторичное антитело после стандартного иммуноокрашивания протокол после фиксации и предварительно конъюгированных варианты с уже этикетку флуоресценции. Наконец на основе антител флуоресценции выгодно из-за большой выбор имеющиеся вторичные или конъюгированные красителей, которые могут быть использованы.
При фиксации и иммуноокрашивания нейронов, это также возможно для пятно для дополнительных белков и выполнять анализ colocalization. Это может помочь определить, где они расположены по отношению к утилизации СВС. Интенсивность флуоресценции лейбла является прямой мерой количество SV рециркуляции. Кроме того антитела выборочно ярлык Syt1-содержащих структур, что приводит к высокой специфичности и мало фона флуоресценции4. Может также использоваться протоколы различные стимуляции, например деполяризации буферов или электрической стимуляции протоколы9,12,,1314. Однако базальный SV рециркуляции могут быть измерены без стимулирования нейрональных культур15.
Наш метод конкретно рассматриваются Syt1 антитела поглощения в двойной transfected нейронов с immunolabeling вторичное антитело после фиксации. Однако мы ссылаемся на всех применяемых вариантов анализа в нашей дискуссии, чтобы дать зрителям возможность адаптировать протокол к конкретным потребностям.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует три анализов, обычно используются для изучения синаптических пузырьков (SV) утилизации. Первые два включают в себя использование) флуоресцентных стириловых красителей например FM1-43, (который инкорпорировать в мембраны, учитываются органеллы во время эндоцитоза и освобожден ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Ирмгард Weiss за экспертной технической помощи. Эта работа была поддержана DFG через кластер передового опыта для микроскопии в нанометровом диапазоне и молекулярной физиологии мозга (CNMPB, B1-7, т.д.).
Materials
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BSA | Sigma | A7030-50g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306-100g | |
| CoolSNAP HQ2 | Photometrics | ||
| dH2O | Invitrogen | 15230 | |
| DABCO | Merck | 8.03456.0100 | |
| donkey anti mouse Alexa 647 | Jackson-Immunoresearch | 715605151 | antibody |
| DMEM | Invitrogen | 41966 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| tube (50 mL) | Greiner Bio-One | 227261 | |
| FBS superior | BiochromAG | S0615 | |
| Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170 | |
| HEPES | Sigma | H4034-500g | |
| Hera Cell 150 (Inkubator) | ThermoElectron Corporation | ||
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541-500g | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030 | |
| MgCl2 | Honeywell | M0250-500g | |
| microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| OpenView Experiment Analysis Application | Free software, see comments | written by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Optimem | Invitrogen | 31985 | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| safety hood | ThermoElectron | Serial No. 40649111 | |
| Sucrose | neoFroxx | 1104kg001 | |
| Synaptotagmin1 | Synaptic Systems | 105311 | mouse monoclonal; clone 604.2 |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Water bath | GFL | 1004 | |
| Zeiss Observer. Z1 | Zeiss | ||
References
- Koh, T., Bellen, H. J. Synaptotagmin I, a Ca2+ sensor for neurotransmitter release. Trends in Neurosciences. 26, 413-422 (2003).
- Chapman, E. R. How Does Synaptotagmin Trigger Neurotransmitter Release. Annual Review of Biochemistry. 77, 615-641 (2008).
- Perin, M. S., et al. Structural and Functional Conservation of Synaptotagmin (p65) in Drosophila and Humans. Journal of Biological Chemistry. 266, 615-622 (1991).
- Matteoli, M., Takei, K., Perrin, M. S., Südhof, T. C., De Camilli, P. Exo-endocytotic Recycling of Synaptic Vesicles in Developing Processes of Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Cell Biology. 117, 849-861 (1992).
- Ko, J., et al. Neuroligin-1 performs neurexin-dependent and neurexin-independent functions in synapse validation. The EMBO Journal. 28, 3244-3255 (2009).
- Shinoda, Y., et al. BDNF enhances spontaneous and activity-dependent neurotransmitter release at excitatory terminals but not at inhibitory terminals in hippocampal neurons. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 27 (2014).
- Ivanova, D., et al. Synaptic activity controls localization and function of CtBP 1 via binding to Bassoon and Piccolo. The EMBO Journal. 34, 1056-1077 (2015).
- Crawford, D. C., Ramirez, D. M. O., Trauterman, B., Monteggia, L. M., Kavalali, E. T. Selective molecular impairment of spontaneous neurotransmission modulates synaptic efficacy. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
- Riemann, D., Wallrafen, R., Dresbach, T. The Kohlschütter-Tönz syndrome associated gene Rogdi encodes a novel presynaptic protein. Scientific Reports. 7, (2017).
- Kim, M., et al. Rogdi Defines GABAergic Control of a Wake-promoting Dopaminergic Pathway to Sustain Sleep in Drosophila. Scientific Reports. 7, 1-14 (2017).
- Schossig, A., Wolf, N. I., Kapferer, I., Kohlschütter, A., Zschocke, J. Epileptic encephalopathy and amelogenesis imperfecta: Kohlschütter-Tönz syndrome. Euopean Journal of Medical Genetics. 55, 319-322 (2012).
- Kraszewski, K., et al. Synaptic Vesicle Dynamics in Living Cultured Hippocampal Neurons Visualized with CY3-Conjugated Antibodies Directed against the Lumenal Domain of Synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15, 4328-4342 (1995).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
- Petkova, A., Goedecke, N., Korte, M., Dresbach, T. Neuroligins mediate presynaptic maturation through brain-derived neurotrophic factor signaling. bioRxiv. , 262246 (2018).
- Fuchs, C., et al. GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses. European Journal of Neuroscience. 38, 3146-3158 (2013).
- Dresbach, T., et al. Functional regions of the presynaptic cytomatrix protein Bassoon: Significance for synaptic targeting and cytomatrix anchoring. Molecular and Cellular Neuroscience. 23, 279-291 (2003).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice. Journal of Visualized Experiments. (65), 4-9 (2012).
- Tsuriel, S., et al. Local sharing as a predominant determinant of synaptic matrix molecular dynamics. PLOS Biology. 4, 1572-1587 (2006).
- Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. Journal of Visualized Experiments. (85), 1-10 (2014).
- Villarreal, S., Lee, S. H., Wu, L. Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), 1-8 (2017).
- Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nature Neuroscience. 17, 10-16 (2014).
- Opazo, F., et al. Limited Intermixing of Synaptic Vesicle Components upon Vesicle Recycling. Traffic. 11, 800-812 (2010).
- Wollebo, H. S., Woldemichaele, B., White, M. K. Lentiviral transduction of neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1078, 141-146 (2013).
- Yang, X., Kaeser-Woo, Y. J., Pang, Z. P., Xu, W., Südhof, T. C. Complexin Clamps Asynchronous Release by Blocking a Secondary Ca2+ Sensor via Its Accessory α Helix. Neuron. 68, 907-920 (2010).
- Wittenmayer, N., et al. Postsynaptic Neuroligin1 regulates presynaptic maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13564-13569 (2009).
- Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive Remodeling of the Presynaptic Cytomatrix upon Homeostatic Adaptation to Network Activity Silencing. Journal of Neuroscience. 31, 10189-10200 (2011).
- Kraszewski, K., Daniell, L., Mundigl, O., De Camilli, P. Mobility of synaptic vesicles in nerve endings monitored by recovery from photobleaching of synaptic vesicle-associated fluorescence. Journal of Neuroscience. 16, 5905-5913 (1996).
- Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nature Neuroscience. 13, 1451-1453 (2010).
- Han, W., et al. N-Glycosylation Is Essential for Vesicular Targeting of Synaptotagmin 1. Neuron. 41, 85-99 (2004).
- Kwon, S. E., Chapman, E. R. Glycosylation is dispensable for sorting of synaptotagmin 1 but is critical for targeting of SV2 and synaptophysin to recycling synaptic vesicles. Journal of Biological Chemistry. 287, 35658-35668 (2012).
- Afuwape, O. A. T., Wasser, C. R., Schikorski, T., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle pool-specific modification of neurotransmitter release by intravesicular free radical generation. The Journal of Physiology. 595, 1223-1238 (2017).
- Sara, Y., Virmani, T., Deák, F., Liu, X., Kavalali, E. T. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
- Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nature Neuroscience. 13, 1454-1456 (2010).
- Bacci, A., et al. Chronic blockade of glutamate receptors enhances presynaptic release and downregulates the interaction between synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated membrane protein 2. Journal of Neuroscience. 21, 6588-6596 (2001).
- Piccoli, G., et al. LRRK2 Controls Synaptic Vesicle Storage and Mobilization within the Recycling Pool. Journal of Neuroscience. 31, 2225-2237 (2011).
- Tracy, T. E., Yan, J. J., Chen, L. Acute knockdown of AMPA receptors reveals a trans-synaptic signal for presynaptic maturation. The EMBO Journal. 30, 1577-1592 (2011).
- Truckenbrdot, S., Viplav, A., Jaehne, S., Vogts, A., Denker, A., Wildhagen, H., Fornasiero, E. F., Rizzoli, S. O. Ageing synaptic vesicles are inactivated by contamination with SNAP25. bioRxiv. , 172239 (2017).
