Un análisis óptico para el reciclaje de la vesícula sináptica en neuronas cultivadas Overexpressing proteínas presinápticas
Summary
Describimos un análisis óptico para la vesícula sináptica (SV) reciclado en neuronas cultivadas. Combinar este protocolo con doble transfección para expresar un marcador presináptico y la proteína de interés nos permite localizar sitios presinápticos, su vesícula sináptica capacidad de reciclaje y determinar el papel de la proteína de interés.
Abstract
En las terminales nerviosas presinápticas activo vesículas sinápticas se someten a ciclos de exo y endocitosis. Durante el reciclaje, el luminales dominios de proteínas transmembranales SV verse expuestos en la superficie celular. Una de estas proteínas es Synaptotagmin-1 (Syt1). Un anticuerpo dirigido contra el dominio luminal de Syt1, una vez añadido al medio de cultivo, se toma durante el ciclo exo-endocytotic. Esta absorción es proporcional a la cantidad de SV reciclaje y puede cuantificarse a través de inmunofluorescencia. Aquí combinamos Syt1 absorción de anticuerpos con doble transfección de neuronas hippocampal cultivadas. Esto nos permite (1) localizar sitios presinápticos en la expresión de marcadores presinápticos recombinante Synaptophysin, (2) determinar su funcionalidad mediante absorción de Syt1 y (3) caracterizar la focalización y efectos de una proteína de interés, GFP-Rogdi.
Introduction
Estudio de vesícula sináptica reciclaje es importante para determinar cómo cambian propiedades presinápticos, en plasticidad sináptica o en respuesta a la perturbación de la función sináptica. Estudio de Synaptotagmin-1 (Syt1) anticuerpos absorción proporciona un método para medir la cantidad de reciclaje de SV. Syt1 es una SV-proteína que actúa como un sensor de Ca2 + y es necesario exocitóticas liberación del neurotransmisor1,2. Es una proteína transmembrana con un dominio citoplásmico c-terminal fuera de la SV y un dominio luminal del N-terminal dentro del SV3. Durante la exocitosis, el dominio luminal de Syt1 queda expuesto al medio externo. A este medio externo, añadimos anticuerpos dirigidos contra el dominio citoplásmico, que se convierte en interiorizado durante la endocitosis. Estos anticuerpos pueden ser que ya sea previamente conjugado con fluoróforos o immunostained con anticuerpos secundarios4,5,6,7. La intensidad de fluorescencia de la immunosignal resultante es proporcional a la cantidad de reciclaje de SV. Este enfoque puede utilizarse para determinar SV constitutiva e inducidas por despolarización reciclaje6,8.
Ensayos de absorción de Syt1 pueden realizarse después de transferencia génica mediada por virus a prácticamente todas las células en el plato o escasa de la transfección de un pequeño número de células. Nuestro método combina el ensayo con escasa doble transfección de neuronas hippocampal primarias utilizando fosfato de calcio9. Utilizamos una proteína recombinante marcador sabida que se acumulan en presynapses, fluorescencia etiquetada Synaptophysin, localizar los terminales presinápticos y sobreexpresan la proteína de interés, Rogdi. Esto nos permite probar si o no Rogdi objetivos funcionales sinapsis y afecta a SV de reciclaje. La codificación Rogdi del gene fue identificado originalmente en una pantalla para mutantes de Drosophila caracterizados por alteración de la memoria10. En los seres humanos, mutaciones en el gene de Rogdi causan una enfermedad devastadora y rara llamada síndrome de Kohlschütter Tönz. Los pacientes sufren de malformaciones de esmalte dental, epilepsia farmacorresistente y retraso psicomotor; sin embargo, la localización subcelular del producto del gen seguía siendo evasiva11. Así, el ensayo de absorción de Syt1 proporcionó evidencia clave para la localización de GFP con la etiqueta Rogdi en sinapsis funcional9.
Esta técnica de absorción tiene varios beneficios. En primer lugar, SV reciclaje puede observarse tanto en tiempo real realizando en proyección de imagen de7,12y después de fijación6,9 midiendo la intensidad de fluorescencia de la etiqueta de Syt1 fluorescencia. Además, se han desarrollado diversas variantes de anticuerpos Syt1. Hay variantes sin etiquetar que pueden ser etiquetadas con un anticuerpo secundario siguiendo un protocolo estándar immunostaining después de la fijación y variantes previamente conjugadas con una etiqueta de fluorescencia ya fijada. Finalmente, basados en anticuerpos de fluorescencia es ventajosa debido a la gran variedad de tintes secundarios o conjugados comercialmente disponibles que se pueden utilizar.
Cuando la fijación y el immunostaining las neuronas, también es posible teñir proteínas adicionales y realizar análisis de colocalización. Esto puede ayudar a determinar dónde se ubican en lo referente a reciclaje SVs. La intensidad de la etiqueta de la fluorescencia es la medida directa de la cantidad de SV de reciclaje. Además, los anticuerpos selectivamente etiqueta de Syt1 que contiene estructuras, dando por resultado alta especificidad y poca fluorescencia de fondo4. Diferentes protocolos de estimulación pueden usarse, como buffers de despolarización o estimulación eléctrica protocolos9,12,13,14. Sin embargo, el reciclaje de SV básico puede medirse sin estimular los cultivos neuronales15.
Nuestro método dirige específicamente Syt1 absorción de anticuerpo en las neuronas transfectadas doble con inmunomarcación de anticuerpo secundario después de la fijación. Sin embargo, nos referimos a todas las variantes usadas rutinariamente el ensayo en nuestra discusión para dar a los espectadores una oportunidad para adaptar el protocolo a necesidades específicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay tres ensayos utilizados habitualmente para el estudio de vesícula sináptica (SV) reciclaje. Los dos primeros incluyen el uso de un) styryl fluorescente tintes como el FM1-43 (que incorporan en las membranas, se toman en orgánulos durante la endocitosis y se liberan después de exocitosis); y b) con la etiqueta fluorescente proteínas recombinantes de SV (que, a la sobreexpresión, incorporan a la maquinaria proteica de reciclaje). Si los fluoróforos acoplados cambian su fluorescencia dependiendo del pH, puede usa…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Irmgard Weiss experta asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por DFG el Cluster de excelencia para la microscopia en la gama del nanómetro y fisiología molecular del cerebro (CNMPB, B1-7, a T.D.).
Materials
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BSA | Sigma | A7030-50g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306-100g | |
| CoolSNAP HQ2 | Photometrics | ||
| dH2O | Invitrogen | 15230 | |
| DABCO | Merck | 8.03456.0100 | |
| donkey anti mouse Alexa 647 | Jackson-Immunoresearch | 715605151 | antibody |
| DMEM | Invitrogen | 41966 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| tube (50 mL) | Greiner Bio-One | 227261 | |
| FBS superior | BiochromAG | S0615 | |
| Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170 | |
| HEPES | Sigma | H4034-500g | |
| Hera Cell 150 (Inkubator) | ThermoElectron Corporation | ||
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541-500g | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030 | |
| MgCl2 | Honeywell | M0250-500g | |
| microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| OpenView Experiment Analysis Application | Free software, see comments | written by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Optimem | Invitrogen | 31985 | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| safety hood | ThermoElectron | Serial No. 40649111 | |
| Sucrose | neoFroxx | 1104kg001 | |
| Synaptotagmin1 | Synaptic Systems | 105311 | mouse monoclonal; clone 604.2 |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Water bath | GFL | 1004 | |
| Zeiss Observer. Z1 | Zeiss | ||
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