Anaerobic विकास और स्तनधारी सेल लाइनों के रखरखाव
Summary
यहाँ, हम एक नई विधि का वर्णन करते हैं जो anaerobic की स्थापित कोशिका रेखाओं की दीर्घकालिक खेती को सक्षम बनाती है. परीक्षण किया गया था कि अधिकतम अस्तित्व समय 17 दिन है । इस विधि साइटोटोक्सिक एजेंटों के परीक्षण के लिए उपयुक्त है और anoxically नकल कोशिकाओं के फिजियोलॉजी की खोज ।
Abstract
अधिकांश श्लैष्मिक ट्यूमर और स्टेम सेल niches में midpoints के साथ सतहों शरीर के भौगोलिक क्षेत्रों है कि anoxic हैं । पिछले अध्ययनों से पता चलता है कि normoxic में मशीन (5% हवा में सह2 ) या hypoxic (कम ऑक्सीजन का स्तर) एक anoxic मशीन द्वारा पीछा शर्तों (नि: शुल्क ऑक्सीजन की अनुपस्थिति) सीमित व्यवहार्यता में परिणाम (2-3 दिन) । एक उपंयास पद्धति विकसित की है कि एक anoxic सेल की खेती में सक्षम बनाता है (कम से 17 दिनों के लिए, अधिकतम समय परीक्षण) । इस कार्यप्रणाली का सबसे अहम पहलू यह सुनिश्चित करना है कि कोई ऑक्सीजन सिस्टम में पेश न हो । यह मीडिया के degassing द्वारा प्राप्त की है, और ट्यूब, बर्तन, कुप्पी, और पिपेट एक anaerobic गैस मिश्रण (एच2, CO2, N2) के साथ निस्तब्धता द्वारा anoxic (गैर ऑक्सीजन) पर्यावरण के लिए equilibrate करने के लिए सामग्री की अनुमति के बाद उपयोग करने से पहले । अतिरिक्त देखभाल जब photomicrographs प्राप्त करने के लिए सुनिश्चित करें कि माइक्रोग्राफ कलाकृतियों शामिल नहीं प्राप्त करने का प्रयोग किया जाना चाहिए । ऑक्सीजन के अभाव में सेल आकृति विज्ञान काफी बदल जाता है । दो अलग morphotypes सभी anaerobically विकसित कोशिकाओं के लिए विख्यात हैं । वृद्धि और ऑक्सीजन के अभाव में स्तनधारी कोशिकाओं को बनाए रखने की क्षमता कोशिका शरीर विज्ञान के विश्लेषण के लिए लागू किया जा सकता, polymicrobial बातचीत, और उपंयास कैंसर दवा विकास के लिए कृत्रिम रास्ते के लक्षण वर्णन ।
Introduction
ठोस ट्यूमर से कोशिकाओं, स्टेम सेल niches, और उन अस्तर श्लैष्मिक सतहों वातावरण में मौजूद है कि अनुभव कम ऑक्सीजन का स्तर, anoxia सहित1,2,3,4। सामांय शारीरिक राज्यों में, ऑक्सीजन हाइपोक्सिया के anoxia (ऑक्सीजन की पूरी अनुपस्थिति)5,6से परे बदलता है । बोध है कि वायुमंडलीय ऑक्सीजन प्रतिकूल स्तनधारी सेल प्रतिकृति को प्रभावित करता है और है कि इन विट्रो सेल विकास में समाप्त ऑक्सीजन शर्तों के तहत अनुकूलित किया जा सकता 1970 के दशक में सूचित किया गया था । रिक्टर एट अल. 7 से पता चला कि 1 – 3% ऑक्सीजन का स्तर (हाइपोक्सिया) बढ़ाया चढ़ाना दक्षता के रूप में वायुमंडलीय ऑक्सीजन की तुलना में (20%). मानवी द्विगुणित कोशिका आयुष्यात८hypoxic संस्कृति की स्थिति में भी विस्तारित है.
vivo में, hypoxic स्थितियों जब ऑक्सीजन भंडार (जैसे, तीव्र व्यायाम के दौरान) समाप्त हो रहे हैं, जिसमें एटीपी उत्पादन एरोबिक श्वसन से किण्वन के लिए कंकाल की मांसपेशी में बंद है (anaerobic श्वसन) के साथ अंत-लैक्टिक एसिड9के उत्पाद । रोग, कैंसर ट्यूमर में, ट्यूमर मास के इंटीरियर गरीब vascularization10के कारण anoxic करने के लिए hypoxic है । ट्यूमर अंदरूनी पर सीमित छिड़काव का प्रभाव स्वतंत्र रूप से ट्यूमर1बाध्य anaerobes द्वारा बृहदांत्र अंदरूनी द्वारा मान्य है । Mechanistically, हाइपोक्सिया में ट्यूमर सेल अस्तित्व हाइपोक्सिया की अभिव्यक्ति पर पूरी तरह निर्भर होने लगा है-inducible फैक्टर 1-अल्फा जीन (HIF1-अल्फा), जो हाइपोक्सिया4,11 के लिए प्रारंभिक सहज प्रतिक्रिया है , 12. HIF1-अल्फा गर्मी सदमे प्रोटीन कि बांध HIF1-अल्फा प्रमोटर और जीन प्रतिलेखन12को विनियमित द्वारा hypoxic शर्तों के तहत प्रेरित है । ये गर्मी सदमे प्रोटीन विभिंन ट्यूमर hypoxic microenvironment में देखा phenotypes की प्रेरण में सहायता करने के लिए माना जाता है । ये phenotypes कोशिका झिल्ली ग्लूकोज ट्रांसपोर्टरों की एक वृद्धि की अभिव्यक्ति का प्रदर्शन और glycolysis की दर (Warburg प्रभाव)13. परिणाम mitochondrial ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण से एक स्विच करने के लिए स्तनपान किण्वन है ।
Anoxic अस्तित्व भी ग्लूकोज के लिए विकल्प का उपयोग करने के अस्तित्व की घटना14,15का समर्थन कर सकते हैं । सबसे अच्छा अध्ययन किया स्तनधारी उदाहरण तिल चूहे, जो एक फ्रुक्टोज संचालित glycolytic किण्वन मार्ग14के माध्यम से ऑक्सीजन के बिना लगभग 20 मिनट के लिए जीवित रह सकते है । एक वैकल्पिक अनुकूलन कुछ मछली में होता है (जैसे, कार्प [Carassius सपा.], जो काफी लंबे समय तक के लिए जीवित रह सकते है अवधि के लिए टर्मिनल के रूप में इथेनॉल के साथ glycolysis का उपयोग कर उत्पाद)15। दोनों ही मामलों में, किण्वन ऑक्सीजन के अभाव में अस्तित्व को सक्षम करने चयापचय ड्राइव । anoxic अस्तित्व के लिए वर्तमान परिकल्पना है कि इतनी देर के रूप में HIF1-अल्फा हाइपोक्सिया के दौरान सक्रिय है, mitochondrial श्वसन, ऑक्सीजन की आवश्यकता के बिना, anaerobic शर्तों के तहत होता है16. इसके अलावा, यह माने है कि hypoxic/anoxic अस्तित्व के लिए एक fermentative मार्ग का उपयोग ट्यूमर अस्तित्व को बढ़ाता है क्योंकि कोशिकाओं ऑक्सीडेटिव तनाव से बचने के जो कोशिका अस्तित्व17के लिए हानिकारक साबित हो सकता है । यह मांगना हाल के एक अध्ययन द्वारा समर्थित है जो दिखाता है कि cardiomyocytes में, हाइपोक्सिया ट्यूमर सेल17पर रखा ऑक्सीडेटिव तनाव कम कर देता है ।
तिथि करने के लिए, anoxic स्तनधारी सेल अस्तित्व के लिए एक fermentative मार्ग की अनिवार्य प्रकृति साहित्य में दिया गया है, कारण, बड़े हिस्से में, अधिक से अधिक 3 दिनों के लिए ऑक्सीजन की पूरी अनुपस्थिति में संस्कृति स्तनधारी कोशिकाओं के लिए अक्षमता । हालांकि, anaerobic अस्तित्व के लिए glycolysis के लिए एक विकल्प बैक्टीरिया में होता है । कुछ बैक्टीरिया, नाइट्रोजन या सल्फेट (अन्य यौगिकों के बीच) में ऑक्सीजन के अभाव में cytochrome oxidase प्रणाली के लिए टर्मिनल इलेक्ट्रॉन स्वीकार्यता के रूप में सेवा कर सकते हैं18. हालांकि जीवाणु और eukaryotic विकास समानांतर पिछले सार्वभौमिक आम पूर्वज से हट कर के बाद से हुई, यह अनुमान है कि mitochondria कोशिकाओं को ऊर्जा प्रदान कर रहे थे १,५४२,००० साल के लिए 19 महासागरों की ऑक्सीजन से पहले . शोधकर्ताओं के बाद से पता चला है कि अलग mitochondria ऑक्सीजन के अभाव में एटीपी का उत्पादन कर सकते हैं, टर्मिनल इलेक्ट्रॉन स्वीकारकर्ता के रूप में नाइट्राइट के साथ, यह मान लेना उचित है कि कोशिकाओं को समय की अवधि के लिए 3 दिन से अधिक ऑक्सीजन के अभाव में कार्य कर सकता है 20 , 21 , 22 , 23. इस अध्ययन में वर्णित कार्यप्रणाली कई कोशिका रेखाओं के anaerobic स्तनधारी सेल वृद्धि के लिए एक उपयोगिता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह विधि पहली बार स्तनधारी कोशिकाओं है कि ऑक्सीजन के अभाव में समय की विस्तारित अवधि के लिए कल्चरित थे का प्रतिनिधित्व करता है । वर्तमान टिप्पणियों के आधार पर, एक गैर fermentative मार्ग के माध्यम से anoxic वृद्धि …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक अपने समर्थन के लिए अनुसंधान और प्रायोजित कार्यक्रमों के Midwestern विश्वविद्यालय के कार्यालय का धंयवाद ।
Materials
| Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
| Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
| pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
| sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
| 50cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
| vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsin | VWR | 25-052-CI | |
| gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
| glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
| inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
| Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
| microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
| test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
| sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
| paper towels | In House | ||
| cell scraper | CellTreat | 229310 | |
| PBS | In house prepared | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
| biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
| Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
| oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
| pH meter | Jenway | 3510 | |
| pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
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