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Biologie du développement

Nanopartikel-vermittelten SiRNA Gen-silencing in Erwachsenen Zebrafisch-Herz

Published: July 29, 2018
doi:
10.3791/58054
, , , , ,
1Beijing Key Laboratory of Cardiometabolic Molecular Medicine, State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Institute of Molecular Medicine,Peking University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering,Peking University

Summary

Es bleibt eine große Herausforderung, bedingte gen-Knockout oder effektive gen-Knockdown in Erwachsenen Zebrafisch Organe zu entwickeln. Hier berichten wir über ein Protokoll zur Durchführung Nanoparticle vermittelte SiRNA Gen-silencing inmitten der Erwachsenen Zebrafisch, wodurch eine neue Verlustfunktion-Methode zur Untersuchung Erwachsenen Organe im Zebrafisch und sonstige Modellorganismen.

Abstract

Säugetiere haben eine sehr begrenzte Kapazität, das Herz nach Myokardinfarkt zu regenerieren. Auf der anderen Seite regeneriert der Erwachsenen Zebrabärbling seine Herz nach Apex Resektion oder Cryoinjury, so dass es ein wichtiger Modellorganismus für die Herz-Regeneration-Studie. Allerdings hat das Fehlen von Verlustfunktion Methoden für Erwachsene Organe Einblicke in die Mechanismen Herz Regeneration beschränkt. RNA-Interferenz über verschiedene Trägersysteme ist ein leistungsfähiges Werkzeug für Gene in Säugetierzellen und Modellorganismen zum Schweigen zu bringen. Wir haben bereits berichtet, dass SiRNA-gekapselte Nanopartikel erfolgreich Zellen eindringen und eine bemerkenswerte Gen-spezifischen Knockdown inmitten regenerierende Erwachsenen Zebrafisch zur Folge. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache, schnelle und effiziente Protokoll für die Dendrimer-vermittelten SiRNA Lieferung und gen-silencing inmitten regenerierende Erwachsenen Zebrafisch. Diese Methode bietet einen alternativen Ansatz zur Ermittlung von Genfunktionen in Erwachsenen Organen im Zebrafisch und auf andere Modellorganismen wie auch verlängert werden kann.

Introduction

Herzinfarkt ist eine große Gesundheitsgefahr, führt zu einer enormen wirtschaftlichen Belastung rund um die Welt1geworden. Die Erwachsenen Säugetier-Herz schlägt fehl, zu regenerieren und wieder aufzufüllen verloren Kardiomyozyten auf einer makroskopischen Skala nach der Verletzung, führt zur Bildung von Narbengewebe und anschließende Herzinsuffizienz. Im Gegensatz zu Säugetieren vermag der Zebrabärbling Herz Regeneration, in erster Linie durch die robuste myokardialen Verbreitung nach verschiedenen Arten von Herz-Verletzungen, so dass es eine ideale Modellorganismus zur Erforschung der molekularen Mechanismen der Herz Regeneration 2,3,4,5,6,7,8. Entschlüsselung der endogenen Mechanismen ist die zugrunde liegende Zebrafisch Herz Regeneration ein spannendes Gebiet der Forschung bei der Suche nach neuartigen therapeutischen Strategien zur Verbesserung der menschlichen Herzens Regeneration9.

Genmanipulation Methoden sind verfügbar im Zebrafisch. Diese bestehen aus Morpholinos (MO), die auch weit verbreitet in Frösche, Küken und Säugetiere neben im Zebrafisch10,11,12,13verwendet werden. MO hat effiziente Knockdown von Ziel-gen-Expression in den Erwachsenen Zebrafisch Fin, Gehirn und Netzhaut14,15,16,17,18,19. Gesperrt-Nuclein-Säure (LNA) ist eine weitere künstliche Oligonukleotid verwendet, um knock down endogenen Genexpression nicht nur in den Zebrafish Embryos, sondern auch Erwachsene tierorganen20,21,22, 23 , 24. das Fehlen von wirksamen Verlustfunktion-Methoden für Erwachsene Herzen bleibt jedoch ein Hindernis bei der Untersuchung der molekularen Mechanismen der Organregeneration. Vorhanden, kleine Molekül-Inhibitoren oder transgene Ausdruck der Dominant-Negative Mutanten dienen in erster Linie die Funktion eines bestimmten Gens oder Weg, seine Funktion in der Erwachsenen Zebrafisch Herz Regeneration25,26 zu studieren zu blockieren ,27. Jedoch nicht alle Gene oder Signalwege sind für diese Methoden anwendbar.

Kleine störende RNAs (SiRNAs) sind für die Verlustfunktion-Analyse im Säugetier-Zellen und Embryonen von Modellorganismen sowie Erwachsenen Organe verbreitet für präklinische Studien in der Tier-Modelle28,29,30 , 31 , 32. SiRNAs effektiv verwendet wurden, um Gene in Tumoren33,34,35 und in Kardiomyozyten36,37,38,39 zum Schweigen zu bringen ,40 über verschiedene Trägersysteme. Vor kurzem haben wir entwickelt effiziente SiRNA-gekapselte Nanopartikel gen-silencing inmitten regenerierende Erwachsene mit mehreren verschiedenen Nanopartikeln41,42,43, bietet ein neuartiges Instrument für die funktionelle Studien von Genen in Erwachsenen Zebrafisch Organe. Basierend auf unseren bisherigen Studien41,42,43, präsentieren hier wir eine einfache, praktische und doch leistungsfähige Protokoll für SiRNA Gen-silencing inmitten regenerierende Erwachsenen Zebrafisch mit f-PAMAM-PEG-R9 Dendrimere. Aldh1a2 (Aldehyde Dehydrogenase 1, Familienmitglied A2) Gen war hochreguliert nach Zebrafisch Apex Resektion und Ablation von Aldh1a2 blockiert die kardialen Regeneration44. Hier nehmen wir als Beispiel die Gen-Knockdown Effizienz vermittelt durch Nanopartikel verkapselt SiRNA Injektion zu testen aldh1a2 gen. Dieses Protokoll enthält ein Verfahren für Zebrafisch Herz Resektion, chemische Synthese von Nanopartikeln und eine Versandart auf SiRNA-gekapselte Nanopartikel in Erwachsenen Zebrafisch Herz.

Protocol

Alle tierische Verfahren verwendet ein Zebrafisch-Protokoll durch die institutionelle Animal Care and Use Committee an der Universität Peking, die vollständig von Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care akkreditiert ist genehmigt. 1. Vorbereitung der Tricaine Lösung Um Tricaine-Stammlösung vorzubereiten, 97,9 mL destilliertem Wasser 400 mg Ethyl 3-Aminobenzoate Methanesulfonate Pulver hinzu, und fügen Sie dann 2,1 mL 1 M Tris (pH 9,5) zur Einstellu…

Representative Results

Um die Effizienz der Dendrimer-vermittelten SiRNA-Lieferung zu bestimmen, wir die Spitze des Ventrikels des Herzens Zebrafisch reseziert, dann ca. 10 µL Dendrimer nur (mock-Gruppe), Cy5-SiRNA nur (nackt-Gruppe) oder f-PAMAM-PEG-R9 Dendrimer-gekapselte injiziert Cy5-SiRNA (Cy5-SiRNA-Gruppe) Intrapleurally bzw. (Abbildung 2A-B). Das Fluoreszenzsignal war nachweisbar in den Herzen injiziert mit Dendrimer-gekapselte Cy5-SiRNA unter 3, 24 und 48 …

Discussion

Der Zebrabärbling ist durchaus in der Lage verschiedenste Organe einschließlich der Erwachsenen Herzen5zu regenerieren. Während transgene und genetische Methoden gut entwickelte für die Erforschung von Genfunktionen in die Embryonen von Zebrafisch sind, stehen Ermittler noch die schwierige Aufgabe bedingte mutierten Allele im Zebrafisch45,46zu generieren. Somit sind transgene Dominant-Negative Mutanten oder Small-Molecule-Hemmer häufi…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Dr. IC Bruce für kritische Anmerkungen und das Manuskript zu lesen. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse vom National Natural Science Foundation of China (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 und 31521062), AstraZeneca Asien und Emerging Market Innovative Medizin und frühe Entwicklung unterstützt.

Materials

tricaine Sigma E10521 Store at 4°C
stereomicroscope Leica  S8AP0
sharp forcep WPI 14098
iridectomy scissors WPI 501778
elbow tweezers Suzhou Liuliu SE05Cr
α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) Biomatrik (Jiaxing) Inc. 5239
core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) Andrews ChemServices AuCS-297
vacuum drying equipment Yiheng DZF-6020
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 14190144
tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) Alfar Aesar 51805-45-9 Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage.
ultrafiltration tube Millipore UFC900308
freeze dryer Martin Christ Alpha 2-4 Ldplus
NMR spectrometer Bruker AV400
Deuterium oxide(D2O) J&K 174611
NMR sample tube J&K WG-1000-7-50
3 kDa MWCO ultrafiltration tube Merck UFC900308
sea salts Instant Ocean® SS15-10
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Citer Cet Article
Xiao, C., Wang, F., Hou, J., Zhu, X., Luo, Y., Xiong, J. Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart. J. Vis. Exp. (137), e58054, doi:10.3791/58054 (2018).
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