בתיווך Nanoparticle siRNA ג'ין להחרשת בלב דג זברה למבוגרים
Summary
זה נשאר אתגר גדול לפתח מותנה נוקאאוט גנטי או יעיל ג’ין-נוקאאוט באיברים דג זברה למבוגרים. כאן אנחנו מדווחים על פרוטוקול עבור ביצוע siRNA בתיווך nanoparticle ג’ין להחרשת בלב דג זברה למבוגרים, ובכך מספק שיטה אובדן-של-פונקציה חדשה ללמוד. האיברים הבוגרים דג זברה ואורגניזמים אחרים מודל.
Abstract
יונקים יש קיבולת מוגבלת מאוד לחדש את הלב לאחר אוטם שריר הלב. מצד שני, דג זברה בוגרת מחדש את הלב שלה לאחר כריתה איפקס או cryoinjury, שהופך אותו אורגניזם מודל חשוב עבור מחקר רגנרציה של הלב. עם זאת, העדר שיטות אובדן-של-תפקוד האיברים הבוגרים הגביל תובנות לגבי המנגנונים הלב התחדשות. התערבות ב RNA באמצעות מערכות אספקה שונים הוא כלי רב עוצמה עבור להשתיק גנים בתרבית של תאים ואורגניזמים מודל. אנחנו דיווחו בעבר כי חלקיקים אנקפסולציה siRNA בהצלחה הזן תאים וגוררים נוקאאוט גנטי ספציפי יוצאת דופן בלב דג זברה בוגרת ההתחדשות. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול פשוט, מהיר ויעיל עבור משלוח siRNA בתיווך דנדרימר ו ג’ין להחרשת בלב דג זברה בוגרת ההתחדשות. שיטה זו מספקת גישה חלופית לקביעת ג’ין פונקציות באיברים למבוגרים בדג זברה, ניתן להרחיב אורגניזמים מודל אחרים גם כן.
Introduction
אוטם שריר הלב, הפכה איום בריאותי גדול, שמוביל נטל כלכלי עצום ברחבי העולם1. הלב יונקים בוגרים נכשלת לחדש, לחדש את cardiomyocytes לאיבוד בקנה מידה מאקרוסקופית אחרי הפציעה, שמוביל היווצרות של רקמות צלקת ואי ספיקת לב עוקבות. בניגוד יונקים, דג זברה הוא מסוגל הלב התחדשות, בעיקר באמצעות התפשטות שריר הלב חזקים לאחר סוגים שונים של פגיעה בלב, שהופך אותו אורגניזם מודל אידיאלי בשביל לחקור את המנגנונים המולקולריים של התחדשות לב 2,3,4,5,6,7,8. התחדשות הבסיסית של הלב דג זברה בפענוח מנגנוני אנדוגני הוא אזור מרגש של מחקר בחיפוש אחר הרומן אסטרטגיות טיפוליות לשפר את לב האדם התחדשות9.
מניפולציה גנטית שיטות זמינות דג זברה. אלה מורכב morpholinos (מו) אשר נמצאים בשימוש נרחב גם צפרדעים, צ’יק, יונקים חוץ דג זברה10,11,12,13. מו יש נוקאאוט יעיל היעד גנים סנפיר דג זברה למבוגרים, המוח ולאחר רשתית14,15,16,17,18,19. נעול-nucleic חומצה (מגבר קדם) היא עוד oligonucleotide מלאכותי המשמש כדי להפיל את ביטוי גנים אנדוגני לא רק בדג זברה עוברי, אלא גם למבוגרים אברי חית20,21,22, 23 , 24. אולם חוסר של שיטות יעילות אובדן-של-פונקציה עבור לבבות המבוגרים נותרה מכשול בפני הלומדים את המנגנונים המולקולריים של התחדשות איברים. מעכבי הנוכחי, מולקולה קטנה או ביטוי הטרנסגניים של מוטציות דומיננטה-שלילי משמשים בעיקר כדי לחסום את הפונקציה של גנים מסוימים או מסלול ללמוד את תפקידה דג זברה בוגרת הלב התחדשות25,26 ,27. עם זאת, לא כל הגנים או איתות המסלולים הינם ישימים עבור שיטות אלה.
RNAs הפרעה קטנה (siRNAs) נמצאים בשימוש נרחב עבור ניתוח אובדן-של-פונקציה בתרבית של תאים, העוברים של מודל אורגניזמים, כמו גם איברים למבוגרים עבור מחקרים פרה חיה מודלים28,29,30 , 31 , 32. siRNAs שימשו באופן יעיל להשתקת גנים גידולים33,34,35 , cardiomyocytes36,37,38,39 ,40 באמצעות מערכות אספקה שונים. לאחרונה פיתחנו nanoparticle אנקפסולציה siRNA יעיל ג’ין-להחרשת בלב למבוגרים ההתחדשות באמצעות מספר חלקיקים שונים41,42,43, מתן כלי הרומן מחקרים פונקציונלי של גנים באיברים דג זברה למבוגרים. על סמך שלנו הקודם מחקרים41,42,43, כאן אנו מציגים עבור siRNA ג’ין להחרשת בלב דג זברה בוגרת ההתחדשות f-PAMAM-פג-R9 משתמש פרוטוקול פשוטה, פרקטית, עדיין חזק dendrimers. Aldh1a2 (אלדהיד דהידרוגנאז 1, בן משפחה A2) ג’ין היה upregulated לאחר כריתה איפקס דג זברה, אבלציה של Aldh1a2 חסם את התחדשות לב44. פה אנחנו לוקחים את aldh1a2 ג’ין לדוגמה כדי לבדוק את יעילות תמונות ציפורים גנים מתווכת על-ידי הזרקת אנקפסולציה nanoparticle siRNA. פרוטוקול זה מכיל הליך כריתה הלב דג זברה, סינתזה של חלקיקים של שיטת משלוח על חלקיקים אנקפסולציה siRNA ללב דג זברה למבוגרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
דג זברה הוא לגמרי מסוגל של רגנרציה מגוון איברים כולל את הלב למבוגרים5. בעוד שיטות מהונדס גנטית הם מפותח ללמוד פונקציות גנים העוברים של דג זברה, החוקרים עדיין עומדות בפנינו משימה מרתיעה של יצירת אללים mutant מותנה בדג זברה45,46. לפיכך, מוטציות דומיננט…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים תודה ד ר ברוס IC תגובות ביקורתיות, לקרוא את כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מן הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 ו 31521062), חברת AstraZeneca אסיה, ולא מתעוררים תרופה חדשנית שוק התפתחות מוקדמת.
Materials
| tricaine | Sigma | E10521 | Store at 4°C |
| stereomicroscope | Leica | S8AP0 | |
| sharp forcep | WPI | 14098 | |
| iridectomy scissors | WPI | 501778 | |
| elbow tweezers | Suzhou Liuliu | SE05Cr | |
| α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) | Biomatrik (Jiaxing) Inc. | 5239 | |
| core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) | Andrews ChemServices | AuCS-297 | |
| vacuum drying equipment | Yiheng | DZF-6020 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) | Alfar Aesar | 51805-45-9 | Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage. |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC900308 | |
| freeze dryer | Martin Christ | Alpha 2-4 Ldplus | |
| NMR spectrometer | Bruker | AV400 | |
| Deuterium oxide(D2O) | J&K | 174611 | |
| NMR sample tube | J&K | WG-1000-7-50 | |
| 3 kDa MWCO ultrafiltration tube | Merck | UFC900308 | |
| sea salts | Instant Ocean® | SS15-10 |
References
- Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics–2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
- Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Dev Biol. 11, 21 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
- Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8 (1), 53748 (2013).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
- Raya, A., et al. Activation of Notch signaling pathway precedes heart regeneration in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11889-11895 (2003).
- Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), 18503 (2011).
- Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138 (16), 3421-3430 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Burns, C. E., Burns, C. G. Zebrafish heart regeneration: 15 years of discoveries. Regeneration (Oxf). 4 (3), 105-123 (2017).
- Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Dev Biol. 222 (1), 124-134 (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
- Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation. Genesis. 30 (3), 198-200 (2001).
- London, C. A., et al. A novel antisense inhibitor of MMP-9 attenuates angiogenesis, human prostate cancer cell invasion and tumorigenicity. Cancer Gene Ther. 10 (11), 823-832 (2003).
- Kizil, C., Otto, G. W., Geisler, R., Nusslein-Volhard, C., Antos, C. L. Simplet controls cell proliferation and gene transcription during zebrafish caudal fin regeneration. Dev Biol. 325 (2), 329-340 (2009).
- Thummel, R., et al. Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo. electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb. Dev Dyn. 235 (2), 336-346 (2006).
- Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), 27395 (2011).
- Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
- Craig, S. E., et al. The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (6), 3244-3252 (2010).
- Thummel, R., Bailey, T. J., Hyde, D. R. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. (58), e3603 (2011).
- Rayburn, E. R., Zhang, R. Antisense, RNAi and gene silencing strategies for therapy: mission possible or impossible. Drug Discov Today. 13 (11-12), 513-521 (2008).
- Seth, P. P., et al. Short antisense oligonucleotides with novel 2′-4′ conformationaly restricted nucleoside analogues show improved potency without increased toxicity in animals. J Med Chem. 52 (1), 10-13 (2009).
- Prakash, T. P., et al. Antisense oligonucleotides containing conformationally constrained 2′,4′-(N-methoxy)aminomethylene and 2′,4′-aminooxymethylene and 2′-O,4′-C-aminomethylene bridged nucleoside analogues show improved potency in animal models. J Med Chem. 53 (4), 1636-1650 (2010).
- Yamamoto, T., Nakatani, M., Narukawa, K., Obika, S. Antisense drug discovery and development. Future Med Chem. 3 (3), 339-365 (2011).
- Itoh, M., Nakaura, M., Imanishi, T., Obika, S. Target gene knockdown by 2′,4′-BNA/LNA antisense oligonucleotides in zebrafish. Nucleic Acid Ther. 24 (3), 186-191 (2014).
- Han, P., et al. Hydrogen peroxide primes heart regeneration with a derepression mechanism. Cell Res. 24 (9), 1091-1107 (2014).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
- McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genet. 3 (10), 737-747 (2002).
- de Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 443-453 (2007).
- Kim, D. H., Rossi, J. J. Strategies for silencing human disease using RNA interference. Nat Rev Genet. 8 (3), 173-184 (2007).
- McCaffrey, A. P., et al. Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference. Nat Biotechnol. 21 (6), 639-644 (2003).
- Raoul, C., et al. Lentiviral-mediated silencing of SOD1 through RNA interference retards disease onset and progression in a mouse model of ALS. Nat Med. 11 (4), 423-428 (2005).
- Hu-Lieskovan, S., Heidel, J. D., Bartlett, D. W., Davis, M. E., Triche, T. J. Sequence-specific knockdown of EWS-FLI1 by targeted, nonviral delivery of small interfering RNA inhibits tumor growth in a murine model of metastatic Ewing’s sarcoma. Cancer Res. 65 (19), 8984-8992 (2005).
- Schiffelers, R. M., et al. Cancer siRNA therapy by tumor selective delivery with ligand-targeted sterically stabilized nanoparticle. Nucleic Acids Res. 32 (19), 149 (2004).
- Yang, X. Z., et al. Systemic delivery of siRNA with cationic lipid assisted PEG-PLA nanoparticles for cancer therapy. J Control Release. 156 (2), 203-211 (2011).
- Ko, Y. T., Hartner, W. C., Kale, A., Torchilin, V. P. Gene delivery into ischemic myocardium by double-targeted lipoplexes with anti-myosin antibody and TAT peptide. Gene Ther. 16 (1), 52-59 (2009).
- Liu, J., et al. Functionalized dendrimer-based delivery of angiotensin type 1 receptor siRNA for preserving cardiac function following infarction. Biomaterials. 34 (14), 3729-3736 (2013).
- Nam, H. Y., Kim, J., Kim, S. W., Bull, D. A. Cell targeting peptide conjugation to siRNA polyplexes for effective gene silencing in cardiomyocytes. Mol Pharm. 9 (5), 1302-1309 (2012).
- Nam, H. Y., McGinn, A., Kim, P. H., Kim, S. W., Bull, D. A. Primary cardiomyocyte-targeted bioreducible polymer for efficient gene delivery to the myocardium. Biomaterials. 31 (31), 8081-8087 (2010).
- Won, Y. W., McGinn, A. N., Lee, M., Bull, D. A., Kim, S. W. Targeted gene delivery to ischemic myocardium by homing peptide-guided polymeric carrier. Mol Pharm. 10 (1), 378-385 (2013).
- Diao, J., et al. PEG-PLA nanoparticles facilitate siRNA knockdown in adult zebrafish heart. Dev Biol. 406 (2), 196-202 (2015).
- Xiao, C., et al. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nat Commun. 7, 13787 (2016).
- Wang, F., et al. A Neutralized Noncharged Polyethylenimine-Based System for Efficient Delivery of siRNA into Heart without Toxicity. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (49), 33529-33538 (2016).
- Kikuchi, K., et al. Retinoic acid production by endocardium and epicardium is an injury response essential for zebrafish heart regeneration. Dev Cell. 20 (3), 397-404 (2011).
- Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise Editing of the Zebrafish Genome Made Simple and Efficient. Dev Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nat Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
- Kesharwani, P., Gajbhiye, V., Jain, N. K. A review of nanocarriers for the delivery of small interfering RNA. Biomaterials. 33 (29), 7138-7150 (2012).
- Luong, D., et al. PEGylated PAMAM dendrimers: Enhancing efficacy and mitigating toxicity for effective anticancer drug and gene delivery. Acta Biomater. 43, 14-29 (2016).
- Luo, K., He, B., Wu, Y., Shen, Y., Gu, Z. Functional and biodegradable dendritic macromolecules with controlled architectures as nontoxic and efficient nanoscale gene vectors. Biotechnol Adv. 32 (4), 818-830 (2014).
- Shcharbin, D., Shakhbazau, A., Bryszewska, M. Poly(amidoamine) dendrimer complexes as a platform for gene delivery. Expert Opin Drug Deliv. 10 (12), 1687-1698 (2013).
